全肺アガロースインフレーション:ex vivoライブイメージングのための肺の準備方法

要約

出典: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment, J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、アガロースを使用してインフレーションを行い、がん細胞と間質細胞との相互作用を研究するためのex vivoライブイメージングのために肺を準備する方法を説明しています。サンプルプロトコルでは、生きた細胞相互作用を観察する前に、アガロースインフレーション手順が説明されています。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. Ex vivo Live Imagingのための肺の準備

>注:肺内の免疫細胞の不必要な挑戦を避けるために、できるだけ無菌で慎重に作業するようにしてください。

1. マウス腹腔内(i.p.)に、IACUCによって承認された動物プロトコルで許可されている麻酔薬の致死的な過剰摂取を注射します。例:.、1 mlの2.5%アベルチン。.マウスが呼吸を停止し、有害な刺激(後足のつまみ)に完全に反応しなくなるのを待ちます
   注:子宮頸部脱臼と二酸化炭素安楽死は、肺細胞の生存率に悪影響を与える可能性があるため、避けるべきです。
2. マウスを解剖ボードに固定し、マウスを70%エタノールで滅菌します。
3. 手術用ハサミを使用して、最初に皮膚から横方向の心窩部切開を行い、次に腹膜から同様の切開を行います。解剖ボードを垂直位置に保持し、下行する大動脈を切断して、血液が胸腔ではなく腹部に溜まるようにします。
4. ダイヤフラムの小さな開口部を切り取って、真空を逃がします。10番目と12番目の肋骨に沿って切断して横隔膜を切除し、肺に視覚的にアクセスできるようにします。
5. 手術用ハサミを使用して、胸郭の上の気管まで皮膚を切りますが、胸郭はそのままにしておきます。胸郭から皮膚を分離します。気管自体を傷つけないように注意しながら、周囲の結合組織を取り除いて気管を露出させます(図1A)。
6. 軟骨輪に平行な露出した気管の直径約1mmの小さな開口部を、喉頭のできるだけ近くで切り取ります(図1B)。気管を完全に切り裂かないように注意してください。
7. 20 Gの針を取り、針を4〜5 mmの針を逆力で気管にそっと挿入します(図1D)。針の端は気管を通して見える必要があります(図1C)。鉗子を使用して、気管内の針を安定させます。あるいは、針を所定の位置に保持するために、縫合糸を気管の周りに結ぶこともできます
   注:挿入しすぎると、カリーナが外傷を負ったり、肺の片側だけが膨らんだりする可能性があります。
8. シリンジに37 °C 2%低融点アガロース (恒温槽から直接採取) 400 μl を入れます。解剖ボードが立ち上がっていることを確認し、温かいアガロースを針を通してゆっくりと肺に注入し、~400μlを使用して肺を膨らませます><。 注意: 胸郭内で肺が膨らむのを見てください。肺が破裂するので、過度に膨らませないでください。
9. 肺が膨らみ、胸郭の~2/3を満たしたら、注射器を取り外し、針を気管内に保持して、アガロースが漏れるのを防ぎます。
10. 膨らませた肺に約50mlの20°CPBSを注ぎ、肺内のアガロースが固まって固まるようにします。ゆっくりと針を取り外し、鉗子で気管を閉じて、固化していないアガロースが漏れないようにします。
11. 胸骨切開術を行って肺を露出させ、その後肺を切除します。肺の切除には、気管を完全に切り裂きながら気管を保持します。気管をそっと引き上げ、結合組織と食道を切り取りながら、肺がマウスから離れるまで肺を胸腔から引き出します(図1E)。
12. 肺を温かいRPMI-1640に浸して過剰な血液を洗い流し、ハサミと鉗子を使用して葉の主幹気管支を門で切断することにより、葉を穏やかに分離します(図1F)。
13. ローブを、イメージング面を最大化するために平らな面を下にして、24ウェルイメージングプレートのウェルに配置します(図1G)。ローブの上に37°CのRPMI-1640を100μl加えます。ローブの上に15mmの円形顕微鏡カバースライドを数枚置き、ローブが浮かないようにします。
14. RPMI-1640メディアが蒸発するのを防ぐために、温かいPBSを周囲のウェルに注ぎます。24ウェルプレートを平衡化した気候チャンバーに挿入し、肺葉を空気と5%CO₂で37°Cに保ちます。クライメートチャンバーを共焦点顕微鏡のステージに挿入します.
    注:他のガス混合物(例えば、_N2中の5%O ₂、5%CO₂)も考慮することができ、低酸素/低酸素条件下での細胞の挙動を調べることができます。

結果

図 1.ライブイメージングのための肺の準備のためのプロトコル。(A)マウス調製後の気管の露出。(B)軟骨輪に平行に露出した気管に作られた小さな切り傷。(C)20Gの針を気管に4〜5mm挿入します。(D)400 μl 2%低融点アガロースを肺に点滴します。(E)マウスから分離した膨らんだ肺。(F)インフレーション後に分離したローブ。(G)24ウェルイメージングプレートのウェルに配置されたローブ。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔剤	NAの	NAの	IACUCによって承認された麻酔、麻酔および/または安楽死に使用されます
PBS、USP滅菌済み	アムレスコ(株)	K813-500ミリリットル	I.V.インジェクション用の超高純度グレード
1X PBSの	UCSF細胞培養施設	NAの
発泡スチロールプラットフォーム	NAの	NAの	解剖ボードとして使用されます
細いハサミは鋭い	ファインサイエンスツール	14060-11
20 G x 1本針、ショートベベル	BDの	305178
鉗子	ロボズサージカルストア	RS-5135
針なし1mLシリンジ	BDの	309659
低融解温度アガロース	ロンザ	50111さん	10mlの溶液を作るには、0.2gのアガロースを秤量し、1 x PBSを10 mlに加え、加熱して溶解します。アガロースは室温で固まるため、インフレーションに使用するまで37°Cのウォーターバスで保持してください。
RPMI-1640 メディウム フェノールレッドなし	ライフテクノロジー	11835-030
24ウェルイメージングプレート	E&K scientific	EK-42892
ガラスカバースライド、15 mm	フィッシャーサイエンティフィック	〒22-031-144
デジタルCO2および温度コントローラー	オコラブ	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
クライメートチャンバー	オコラブ	NAの	http://www.oko-lab.com
Cell Observer スピニングディスク共焦点顕微鏡	ツァイス	NAの
空気	カリフォルニア大学サンフランシスコ校	NAの
酸素	カリフォルニア大学サンフランシスコ校	NAの
二酸化炭素	カリフォルニア大学サンフランシスコ校	NAの