肺癌細胞の3次元培養:細胞-マトリックス相互作用を研究する方法

要約

出典:Chen, S. et. al. 肺扁平上上皮癌の進行をモデル化するための多次元共培養システム。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、細胞とマトリックスの相互作用を研究するための肺癌細胞の3D培養の技術について説明しています。このプロトコルでは、TUM622 肺がん細胞の 3D 培養を行い、in vitro でオルガノイドを形成する可能性を探ります。

プロトコル

1. TUM622細胞の2D培養における継代と培養

1. TUM622細胞用の温温3D培地および細胞解離試薬(材料表を参照)を37°Cで使用。
2. TUM622細胞を2Dフラスコで80%のコンフルエント度で継代します。通常、これは通過後1週間で発生します。
3. T75フラスコから古い培地を捨て、6 mLのHEPES緩衝液で1回洗浄します。細胞に直接ピペッティングすることは避けてください。
4. HEPESバッファーを吸引します。4 mLのトリプシン/ EDTA(0.25 mg / mL、材料の表を参照)を追加してすばやくすすぎ、トリプシン/ EDTAを廃棄します。.
5. トリプシン/EDTAを2mL加え、37°Cで5分間インキュベートし、インキュベーターからフラスコを取り出し、フラスコを軽くたたいて気泡を作らずに細胞を緩め、フラスコをさらに5分間インキュベーターに戻します
   手記：トリプシンへの長期の曝露は不可逆的に細胞を損傷し、その表現型を変えるため、細胞がトリプシンにさらされる時間を制限することが推奨されます。
6. 細胞が分離し、解離したことを光学顕微鏡(4倍または10倍)で確認します。4 mLの中和バッファー(TNSバッファー)を加え(材料表の継代試薬情報を参照)、続いて10 mLの3D培地(材料表を参照)を加えます。
7. ピペットをゆっくりと上下させ、10 mLピペットを使用して細胞をさらに解離します。懸濁液を40 μmのセルストレーナーを介して50 mLのコニカルチューブに移します。
8. 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントします。
9. 0.8 x 10⁶細胞/T75フラスコを20 mLの3D培地に播種します(材料の表を参照)。
10. 使用済みの培地の半分を新鮮な培地と交換することにより、一日おきに細胞に栄養を与えます。

2. 3D培養のための細胞外マトリックスへのTUM622細胞のプレーティング

1. 実験の前日に、基底膜マトリックスのバイアルを4°Cの冷蔵庫で一晩解凍します。プラスチックピペット(2 mL)とチップを-20°Cで一晩クールダウンします.
   手記：基底膜マトリックスのすべてのロットが、TUM622細胞の3D増殖をサポートする能力が同じであるわけではありません。したがって、堅牢なアシニ形成をサポートする基底膜マトリックスを特定するために、複数のロットの基底膜マトリックスを取得してテストする必要があります。通常、これにはマトリックス中のより高いタンパク質濃度(16-18 mg / mL)が必要です。
2. 実験当日は、37°Cの水浴で温めた3D培地、HEPESバッファー、トリプシン/EDTA、トリプシン中和バッファー(TNS)を温めます。培養物を設置する直前に、解凍した基底膜マトリックスを冷蔵庫から取り出し、バイアルを氷の上に置きます。
3. 氷の上に置かれた金属製のプラットフォームクーラーで組織培養プレートを冷却します。遠心分離管を氷の上の金属製冷却ラックに置きます。
4. ステップ 1.7 で取得した TUM622 セルを使用して、めっきに必要なセル数を計算します。通常、24ウェルプレートのウェルあたり15,000〜30,0000個の細胞が必要です。イメージングや定量には低密度が適しており、RNA抽出やウェスタンブロッティングのために細胞を採取する場合は高密度が好まれます。
5. 細胞懸濁液を冷却した遠心分離管(各チューブには三重めっき用の細胞が入っています)に移し、ハンギングバケット遠心分離機で4°Cで300 x gで5分間スピンダウンします。
6. ろ過されていないチップ(20 μL)に取り付けられた吸引ピペットで上清を慎重に吸引し、チューブ内に約100 μLの培地を残します(チューブのマーキングを目安として使用してください)。
7. チューブの側面を軽くたたいて、ペレットを取り外して解離してから、冷却ラックに戻します。
8. 2 mLの予冷ピペットを使用して、バイアルを氷に接触させたまま、数回ピペッティングで上下させてマトリックスを穏やかに混合します。この手順中にマトリックスに気泡が入らないように、均一で適度な速度でピペットを動かします。
9. マトリックスの適切な容量を各遠心分離チューブに移します。24ウェルプレートにトリプリケートをめっきする場合は、各チューブに1.1 mLの基底膜マトリックスを添加します。
10. 予冷したチップを使用して、各チューブ内のマトリックスを約10回上下にピペットで動かし、均一な細胞懸濁液を作ります。
11. 310 μLの細胞/マトリックス懸濁液を、予冷した24ウェルプレートの各ウェルに移します。ピペットはプレート表面に対して90°の角度で配置され、懸濁液はウェルの中央に追加されます。懸濁液は、プレートを傾けることなく、広がり、ウェル全体を覆う必要があります。
12. ダウンストリームの免疫蛍光分析を容易にするために、細胞/マトリックス懸濁液を2ウェルチャンバースライドに並列にプレートします。100 μL の細胞/マトリックス懸濁液を 2 ウェルチャンバースライドのウェルの中央に移します (材料の表を参照)。これにより、マトリックスははるかに小さな体積でドーム状の構造を形成することができます。
13. プレートを戻すと、チャンバーがスライドして組織培養インキュベーターに戻り、マトリックスが固化するまで30分間インキュベートします。光学顕微鏡でプレート/スライドを検査し、単一細胞がマトリックス内に均一に分布していることを確認します(4倍または10倍)。
14. 予熱した3D培養完全培地1 mLを各ウェルに加え、チャンバースライドの各ウェルに3D培地1.5 mLを加えてから、インキュベーターに戻します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
気管支上皮成長培地	ロンザ	CC-3170 ベグム
セルストレーナー40um	サーモフィッシャー	352340	TUM622セルの通過用
クールラック CFT30	バイオシジョン	BCS-138	3Dカルチャー用
クールシンクXT96F	バイオシジョン	BCS-536	3Dカルチャー用
Cultrex 3D細胞採取キット	バイオテクネ	3448-020-K
マトリゲル(単一栽培に好まれる)	コーニング	356231	3Dカルチャー用
Lab-Tec II チャンバー付き #1.5 ドイツ製カバーガラスシステム	ナルゲ・ヌンク・インターナショナル	155409 (8)	3Dカルチャー用
Lab-Tec II チャンバー付き #1.5 ドイツ製カバーガラスシステム	ナルゲ・ヌンク・インターナショナル	155379 (2)	3Dカルチャー用
ReagentPack サブカルグリ試薬	ロンザ	CC-5034	TUM622細胞解離用

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