RNA抽出アッセイ:miRNAトランスフェクト肺がん細胞からRNAを抽出する方法

要約

出典:Hossian, A. K. M. N. et al., Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、miRNAトランスフェクション肺がん細胞からのRNA抽出プロトコルについて説明しています。このアプローチは、細胞周期と血管新生を停止させる組み合わせmiRNA治療活性を特定するために使用できます。

プロトコル

1. miR-143およびmiR-506トランスフェクション

>注意:説明されている実験を実行するときは、ラテックス手袋、保護眼鏡、および実験室のコートを使用してください。必要に応じて、気道を塞いだり、層流を妨げたりすることなく、キャビネットファンをオンにした状態でバイオセーフティキャビネットを使用してください。保護ガラス窓は、製造元の説明に従って、常に適切な高さに設定してください。

1. 10% FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシン(培養培地)を添加したDMEM/F12K培地のT25 cm²フラスコ/6/96ウェルプレートにNSCLC A549細胞を播種し、組織培養フードで5%_CO2を用いて37°Cで一晩インキュベートします。
2. miR-143 および miR-506 mimic を懸濁するか、siRNA をトランスフェクション剤 (2.4 μg の miR を 14 μL のトランスフェクション剤と 14 μL のトランスフェクション剤と混合、材料表を参照) で 500 μL のトランスフェクション培地と 1.5 mL の血清および抗生物質を含まない DMEM/F12K 培地にスクランブルし、最終 miRNA 濃度を 100 nM にします。適切なアプローチには、miRNAの濃度の増加(すなわち、50-200 nM)による細胞のトランスフェクション、および目的遺伝子の発現ダウンレギュレーションの評価が含まれます。
3. フラスコ/プレートから培地を取り出し、1x PBSで一度洗浄します。
4. miRNA/スクランブルトランスフェクション剤複合体を添加し、5% CO₂ と共に 37 °C で 6 時間インキュベートします(フラスコのサイズは添加インキュベーション量を定義します)。
5. 培地を4 mLの培養培地と交換し、細胞を24時間および/または48時間インキュベー
トします。
6. トランスフェクションした細胞をトリプシン化し、各T25 cm²フラスコに1 mLのトリプシン-EDTAを加え、37°Cで5〜10分間インキュベートし、3 mLの培養培地を加えて細胞を回収します。各フラスコの内容物を、マークされた別々の15 mLチューブに入れます。ティッシュカルチャーフードで作業します。
7. 751 x gで5分間遠心分離し、上清を取り除きます
   手記：上清の除去には注意が必要です。チューブの攪拌により細胞が失われる可能性があるためです。
8. 1x PBSを2 mL加え、751 x gで5分間遠心分離します。
9. 手順 7 と 8 を 1 回繰り返して、メディアと上清の痕跡をすべて取り除きます。
   手記：この段階では、サンプルチューブは-80°Cで保存することも、すぐに使用することもできます。

2. RNA抽出

1. 70%イソプロピルアルコールとRNAse除染液を噴霧して、作業エリアを清掃します。
2. RNA抽出は、適切なRNAキットを使用して行う必要があります(材料表を参照)。
3. チューブを-80°Cから取り外し、解凍します。300 μLの溶解バッファーを加え、ピペットで上下に動かして細胞膜を切断します。
4. 等量の100%超高純度エタノールを加えます。
5. よく混ぜて、分離カラムに入れます。
6. 11 x g から 16 x g を 30 秒間遠心分離し、フロースルーを取り出します。
7. 400 μLの洗浄バッファーを加え、遠心分離機でバッファーを除去します。
8. 各サンプルに5 μLのDNAse Iと75 μLのDNA消化バッファーを加え、15分間インキュベートします。
9. サンプルを400 μLのRNA調製バッファーで洗浄します。
10. RNA洗浄バッファーで2回洗浄します。
11. ヌクレアーゼフリーの水をカラムに加え、遠心分離してからRNAを回収します。
12. UV分光光度計で総RNA濃度を測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A549 非小細胞肺がん細胞	ATCCの	ATCC CCL-185
Ambion Silencer ネガティブコントロール No. 1 siRNA	アンビオン	AM4611
has-miR-143-3p miRNA ミミック	ABMの	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA ミミック	ABMの	MCH02824
ウシ胎児血清(FBS)	フィッシャーサイエンティフィック	10438026
HyClone リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	フィッシャーサイエンティフィック	SH30256FS
DMEM 4.5 g/L グルコース、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン配合	VWRの	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure DNase/ RNase-Free 蒸留水	インビトゲン	〒10-977-015
Quick-RNAキット	ザイモリサーチ	R1055
エタノール、絶対(200プルーフ)、分子生物学グレード、	フィッシャーバイオ試薬	BP2818500
-80°C冷凍庫	VWRの	VWR40086A
ナノドロップ	サーモサイエンティフィック	NanoDropワンC
96ウェルプレート	セルトリート・サイエンティフィック	50-607-511
ペニシリン-ストレプトマイシン10/10	アントランタバイオロジカルズ	B21210
CO2インキュベーター	サーモサイエンティフィック	ヘラセル150i
DNAアーゼ	ザイモリサーチ	E1010
F-12K 栄養混合物 (Kaighn's Mod.) with L-グルタミン, コーニング	コーニング	45000-354
ウシ胎児血清 - プレミアム	アントランタバイオロジカルズ	S11150
温度制御遠心分離機マチン	サーモサイエンティフィック	ST16Rの
温度制御されたマイクロ遠心分離機のmatchine	エッペンドロフ	5415Rの

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