細胞周期解析:miRNAトランスフェクション肺がん細胞の細胞周期調節を研究するためのアプローチ

要約

出典:Hossian, A. K. M. N., et al.細胞周期と血管新生を調節するためのコンビナトリアルmiRNA治療の解析。J. Vis. Exp.(2019年)。

miRNAまたはmicroRNAは、細胞周期の進行の主要な調節因子です。このビデオでは、miRNA が細胞周期調節に及ぼす影響を研究するために、miRNA をトランスフェクトした肺がん細胞のフローサイトメトリーベースの細胞周期解析について説明します。細胞周期の進行を止めることによる増殖の阻害は、がん治療の有望なアプローチである可能性が示されています。

プロトコル

1. miR-143およびmiR-506トランスフェクション

>注意:説明されている実験を実行するときは、ラテックス手袋、保護眼鏡、および実験室のコートを使用してください。必要に応じて、気道を塞いだり、層流を妨げたりすることなく、キャビネットファンをオンにした状態でバイオセーフティキャビネットを使用してください。保護ガラス窓は、製造元の説明に従って、常に適切な高さに設定してください。

1. 10% FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシン(培養培地)を添加したDMEM/F12K培地のT25 cm²フラスコ/6/96ウェルプレートにNSCLC A549細胞を播種し、組織培養フードで5%_CO2を用いて37°Cで一晩インキュベートします。
2. miR-143 および miR-506 mimic を懸濁するか、siRNA をトランスフェクション剤 (2.4 μg の miR を 14 μL のトランスフェクション剤と 14 μL のトランスフェクション剤と混合、材料表を参照) で 500 μL のトランスフェクション培地と 1.5 mL の血清および抗生物質を含まない DMEM/F12K 培地にスクランブルし、最終 miRNA 濃度を 100 nM にします。適切なアプローチには、miRNAの濃度の増加(すなわち、50-200 nM)による細胞のトランスフェクション、および目的遺伝子の発現ダウンレギュレーションの評価が含まれます。
3. フラスコ/プレートから培地を取り出し、1x PBSで一度洗浄します。
4. miRNA/スクランブルトランスフェクション剤複合体を添加し、5% CO₂ と共に 37 °C で 6 時間インキュベートします(フラスコのサイズは添加インキュベーション量を定義します)。
5. 培地を4 mLの培養培地と交換し、細胞を24時間および/または48時間インキュベー
トします。
6. トランスフェクションした細胞をトリプシン化し、各T25 cm²フラスコに1 mLのトリプシン-EDTAを加え、37°Cで5〜10分間インキュベートし、3 mLの培養培地を加えて細胞を回収します。各フラスコの内容物を、マークされた別々の15 mLチューブに入れます。ティッシュカルチャーフードで作業します。
7. 751 x gで5分間遠心分離し、上清を取り除きます
   手記：上清の除去には注意が必要です。チューブの攪拌により細胞が失われる可能性があるためです。
8. 1x PBSを2 mL加え、751 x gで5分間遠心分離します。
9. 手順 7 と 8 を 1 回繰り返して、メディアと上清の痕跡をすべて取り除きます。
   注:この段階では、サンプルチューブは-80°Cで保存することも、すぐに使用することもできます。

2. 細胞周期解析

1. T25 cm²フラスコに各サンプルについて5 x 10⁵細胞を播種し、セクション1のステップ1〜5に記載されているプロトコルに従ってトランスフェクションを行います。
2. 24時間後と48時間後、トリプシン処理により細胞を回収します。
3. 細胞懸濁液を15 mLの滅菌チューブに移し、適切に標識します。
4. サンプルを751 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
5. 氷冷した1x PBSを2 mL加え、ボルテックスし、751 x gで5分間遠心分離します。
6. 1x PBSで洗浄手順を繰り返して、残留メディアを取り除きます。
7. ピペッティングで氷冷した1x PBSを200 μL加えて、ペレットを再懸濁して破砕します。
8. 2 mLの氷冷エタノールをチューブに滴下し、穏やかにボルテックスしながら細胞を固定します。
9. チューブを室温で30分間インキュベートし、チューブを4°Cで1時間放置します。
10. チューブを4°Cから取り出し、751 x gで5分間遠心分離します。
11. 氷冷した1x PBSを2 mL加え、ボルテックスし、751 x gで5分間遠心分離します。
12. ヨウ化プロピジウム(50 μg/mL)およびリボヌクレアーゼA(200 μg/mL)を含む1x PBS500 μLを添加します。
13. サンプルを光から保護しながら、室温で30分間インキュベートします。
14. フローサイトメーターでデータを取得します。前方散乱光対側散乱光(FSC対SSC)を使用して、FSC対SSC密度プロットの左下隅にある破片とFSC対SSC密度プロットの上部から右上にあるセルクラスターを除外して、セルの主な集団を選択します。
15. 適切なソフトウェアを使用して、細胞周期ステージごとの細胞集団を同定するためのデータを解析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM 4.5 g/L グルコース、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン配合	VWRの	VWRL0100-0500
ウシ胎児血清 - プレミアム	アントランタバイオロジカルズ	S11150
ウシ胎児血清(FBS)	フィッシャーサイエンティフィック	10438026
ペニシリン-ストレプトマイシン10/10	アントランタバイオロジカルズ	B21210
ウシ膵臓由来のリボヌクレアーゼA	シグマ	R6513-50MG
ヨウ化プロピジウム	MPバイオケミカルズLLC	IC19545825
エタノール、絶対(200プルーフ)、分子生物学グレード	フィッシャーバイオ試薬	BP2818500
CO2インキュベーター	サーモサイエンティフィック	ヘラセル150i
A549 非小細胞肺がん細胞	ATCCの	ATCC CCL-185
96ウェルプレート	セルトリート・サイエンティフィック	50-607-511
FACS Calibur フローサイトメーター	ベクトン・ディキンソン
Thermo Scientific BioLite 細胞培養処理フラスコ	サーモサイエンティフィック	12-556-009
温度制御遠心分離機マチン	サーモサイエンティフィック	ST16Rの
温度制御されたマイクロ遠心分離機のmatchine	エッペンドロフ	5415Rの
SpectraTube遠心分離管15ml	VWRの	470224から998
モッドフィットLT	Verityソフトウェア		ステップ2.15:細胞周期の集団分布を解析するための代替ソフトウェア
Fisherbrand Basix マイクロ遠心チューブ 標準スナップキャップ付き	フィッシャーブランド バシックス	02-682-002
has-miR-143-3p miRNA ミミック	ABMの	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA ミミック	ABMの	MCH02824
F-12K L-グルタミン配合栄養剤 (Kaighn's Mod.)	コーニング	コーニング45000-354
ネガティブ80°Cフリーザー	VWRの	VWR40086A

シリーズ