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1. miR-143およびmiR-506トランスフェクション
>注意:説明されている実験を実行するときは、ラテックス手袋、保護眼鏡、および実験室のコートを使用してください。必要に応じて、気道を塞いだり、層流を妨げたりすることなく、キャビネットファンをオンにした状態でバイオセーフティキャビネットを使用してください。保護ガラス窓は、製造元の説明に従って、常に適切な高さに設定してください。
- 10% FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシン(培養培地)を添加したDMEM/F12K培地のT25 cm2フラスコ/6/96ウェルプレートにNSCLC A549細胞を播種し、組織培養フードで5%CO2を用いて37°Cで一晩インキュベートします。
- miR-143 および miR-506 mimic を懸濁するか、siRNA をトランスフェクション剤 (2.4 μg の miR を 14 μL のトランスフェクション剤と 14 μL のトランスフェクション剤と混合、材料表を参照) で 500 μL のトランスフェクション培地と 1.5 mL の血清および抗生物質を含まない DMEM/F12K 培地にスクランブルし、最終 miRNA 濃度を 100 nM にします。適切なアプローチには、miRNAの濃度の増加(すなわち、50-200 nM)による細胞のトランスフェクション、および目的遺伝子の発現ダウンレギュレーションの評価が含まれます。
- フラスコ/プレートから培地を取り出し、1x PBSで一度洗浄します。
- miRNA/スクランブルトランスフェクション剤複合体を添加し、5% CO2 と共に 37 °C で 6 時間インキュベートします(フラスコのサイズは添加インキュベーション量を定義します)。
- 培地を4 mLの培養培地と交換し、細胞を24時間および/または48時間インキュベー
トします。
2. 抗体細胞周期マイクロアレイによるタンパク質発現
- T25 cm2フラスコに各サンプルについて5 x 105細胞を播種し、セクション1、ステップ1〜5に記載されているプロトコルに従ってトランスフェクションを行います。
- 24時間後および48時間後、トリプシン処理により細胞を回収します。
- 細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、それに応じて標識します。
- 751 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 氷冷した1x PBSを2 mL加え、ボルテックスし、751 x gで5分間遠心分離します。
- 1x PBSで洗浄ステップを繰り返します。
- プロテアーゼ阻害剤を添加した溶解緩衝液150μLを添加します。ピペで優しく上下させて、細胞膜を破壊します。
- 溶解バッファーの干渉を防ぐには、メーカーの溶媒交換カラムを使用して、バッファー交換を行い、溶解バッファーをラベリングバッファーに置き換えてください。
- BCAアッセイで総タンパク質を定量します。
- 70 μgのタンパク質サンプルを採取し、標識バッファーを添加して、最終容量75 μLを達成します。
- 100 μLのジメチルホルムアミド(DMF)を1 mgのビオチン試薬(ビオチン/DMF)に加えます。
- 各タンパク質サンプル(ビオチン化タンパク質サンプル)に3 μLのビオチン/DMFを添加し、室温で2時間インキュベー
トします。
- 35 μLの停止試薬を加え、ボルテックスにより混合します。
- サンプルを室温で30分間インキュベートします。
- マイクロアレイスライドを冷蔵庫から取り出し、使用前にRTまで1時間温めます。
- スライドを3%粉ミルク溶液(メーカー提供のブロッキング試薬)とペトリ皿内でインキュベートし、RTで45分間連続振とうすることにより、非特異的結合のブロッキングを行います。
- スライドをddH2O水で洗浄します(特に指定がない限り、洗浄はddH2Oで行われます)。
- 洗浄ステップを~10回繰り返して、スライド面からブロッキング溶液を完全に除去します。これは、均一で低い背景を実現するために重要です。
- スライド表面から余分な水分を取り除き、スライドを乾かさずに次のステップに進みます。
- カップリング試薬に3%粉ミルクを溶解することにより、カップリング溶液を調製します。
ステップ- 12で調製したビオチン化タンパク質サンプルの全量に、カップリング溶液6 mLを加えます。
- ベンダーから提供されたカップリングチャンバーの1つのウェルにスライドを1枚入れ、それに~6mLのタンパク質カップリングミックスを加えます><。
手記：スライドがタンパク質カップリングミックス溶液に完全に浸されていることを確認してください。
- カップリングチャンバーを覆い、軌道シェーカーで連続的に攪拌しながらRTで2時間インキュベートします。
- スライドをペトリ皿に移し、1x洗浄バッファー30mLを加えます。ペトリ皿をオービタルシェーカーに入れ、10分間振とうし、溶液を捨てます。
- 手順 24 を 2 回繰り返します。
- ステップ17および18で説明したように、スライドをddH2O水で広範囲にすすぎ、乾燥を避けるためにすぐに次のステップに進みます。
- 30 mLの検出バッファーに30 μLのCy3-ストレプトアビジン(0.5 mg/mL)を加えます。
- スライドをペトリ皿に入れ、Cy3-ストレプトアビジンを含む検出バッファー30mLを加えます。
- オービタルシェーカーで20分間インキュベートし、光から保護された連続振とうを行います
手記：Cy-3は蛍光色素です。蛍光強度を維持するために、アルミホイルで覆うか、暗い条件下で操作します。
- 手順24〜26を実行し、穏やかな空気の流れを使用してスライドを乾燥させるか、スライドを50 mLのコニカルチューブに入れ、1300 x gで5〜10分間遠心分離します。
- スライドをスライドホルダーに置き、アルミホイルで覆います。
- マイクロアレイスキャナーでスライドを適切な励起波長と発光波長でスキャンします。Cy3の場合、励起波長のピークは~550 nm、発光のピークは~570 nmです。
- データを分析します(使用するソフトウェアについては、資料の表を参照してください)。