フローサイトメトリーのためのマウス肺調製:フローサイトメトリー解析のための肺組織からの細胞懸濁液の生成(英語)

要約

出典:Moll, H. P., et al. Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、肺腺がん細胞のPD-L1発現を研究するためのフローサイトメトリー分析のためのマウス肺細胞懸濁液の調製について説明しています。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. フローサイトメトリーのための肺の準備

1. 所望の実験エンドポイントで、ケタミン (100 mg/kg 体重) とキシラジン (10 mg/kg 体重) の混合物の皮下注射によりマウスを鎮静させ、子宮頸部脱臼により安楽死させます。
2. 死体を70%エタノールに浸し、テープを使用してマウスを解剖板に固定します。
3. 腹側正中線切開を行い、皮膚を穏やかに反転させて胸壁の筋肉と腹部の臓器を露出させます。横隔膜に穴を開け、ハサミで肋骨を切って胸腔を露出させます。
4. 左心室の小さな開口部を切開して血液が出るようにした後、27Gの針を使用して右心室に6〜8mLの氷冷PBSを肺に3回灌流します。肺から血液が取り除かれ、完全に白くなるはずです。
5. 肺を取り出し、はさみを使って葉を細かく刻みます。肺片を2 mLの微量遠心チューブに移し、1.5 mLの肺消化バッファー(RPMI、5% FCS、150 U/mLコラゲナーゼI、および50 U/mL DNase I)でインキュベー
トします。
6. 肺片を37°Cで30〜60分間、絶えず振とうしながらインキュベートします。
7. 肺細胞懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーを介して50 mLチューブに移します。滅菌済みの10 mLシリンジの背面でストレーナーを空にし、2%FCSを含む15 mLのPBSでストレーナーをすすぎます。.
8. 細胞を300 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。細胞を1 mLのアンモニウム-塩化カリウム(ACK)溶解バッファーに再懸濁し、室温で5分間インキュベートして、残存赤血球を溶解します。
9. 細胞を300 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、細胞を2% FCSを含むPBS1 mLに再懸濁し、フローサイトメトリー
   の所望の染色プロトコルに進みます 手記： あるいは、細胞を30%のFCSおよび10%のDMSOを含むRPMIに再懸濁し、凍結容器を使用して凍結し、後で分析することもできます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス肺腺がん細胞株			社内で分離
C57Bl/6マウス			2つの背景の十字架のF1を使用できます(8〜12週間)
129Sマウス
RPMI 1640 ミディアム	ライフテクノロジー	11544446
子牛胎児血清	ライフテクノロジー	11573397
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液	ライフテクノロジー	11548876
L-グルタミン	ライフテクノロジー	11539876
ケタゾール(100 mg / mLケタミン)	オグリスファーマ	〒8-00173
キシラゾール(20 mg / mLキシラジン)	オグリスファーマ	〒8-00178
鈍い鉗子	ロボズ	RS8260
学生用アイリスハサミ	ファインサイエンスツール	91460から11
DNase I (RNaseフリー)	ニューイングランドバイオラボ	M0303S(英語)
コラゲナーゼI型	ライフテクノロジー	17100017
ACKライジングバッファー	ロンザ	10-548E

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