免疫蛍光アッセイ:医療用ワイヤーに捕捉された腫瘍細胞を同定する方法

要約

出典:Gallerani, G. et.al., Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、機能化された医療用ワイヤーに捕捉された循環腫瘍細胞の免疫蛍光染色の技術について説明しています。官能基化されたワイヤーにより、患者の血流から直接in vivoでCTCを分離できます。

プロトコル

1. Immuno-DNA FISH on Wire (英語)

1. 細胞株のワイヤー上スパイクイン(3Dサポート)
   手記：予備セットアップには、EpCAM陽性に基づく接着細胞株の正確な選択が含まれます。ワイヤーは抗EpCAM抗体で官能基化されているため、EpCAM陽性細胞のみが染色されます
   手記：損傷を避けるために、ワイヤーの機能化された部分に触れないでください。
   手記：すべてのステップは、無菌状態の層流フードの下で実行する必要があります。
   1. T75フラスコ(80%コンフルエンス)の全内容物を5 mLバイアルに再懸濁し、4 mLの完全培地を使用します。1回のスパイクインでは、ワイヤーへの細胞接着を最大化するために約2,000,000個の細胞を推奨します。
   2. ワイヤーをガラスパッケージから取り出します。
   3. ワイヤーの官能基化された金部分をバイアルに浸し、ワイヤーストッパーがバイアルに水密にフィットしていることを確認します。ラボ用フィルムでシールします.
      手記：ワイヤーストッパーとバイアルを正しく一致させるために、5 mLチューブの使用をお勧めします。
   4. チューブローテーター(0-120角度)でRTで30分間インキュベートします。
   5. 3種類の清浄バイアルを使用して、1×PBS溶液でワイヤーを3回すすぎます。
2. 固定と透過化
   注意：アセトンは、気道を刺激する可能性のある可燃性物質です。アセトン耐性プラスチックまたはガラス容器のみを使用してください(PVCまたはPVDFは使用しないでください).
   手記：これらの手順は、化学薬品ヒュームフードの下で実行します。
   1. ワイヤーを風乾します。
   2. ワイヤーをアセトン100%溶液に室温で10分間浸して細胞を固定します。5mLのチューブを使用します。
      手記：ワイヤーストッパーが固定剤に接触してはいけません。
   3. ワイヤーをRT.
      で5分間風乾します 手記：ここでプロトコルを一時停止できます。ワイヤーは-20°Cで保管する必要があります。長期保存用の電線を梱包する場合は、機能化先端を加工した先端の隣にワイヤーストッパーを置き、機能化した先端を傷つけないように注意しながら、ワイヤーを収納ガラス管に慎重に挿入してください。保管用ガラスを閉じ、-20°Cで(垂直または水平に)保管します。
3. 免疫蛍光 Day 1
   手記：この段階では、一晩のインキュベーション(~16時間)が行われます。
   1. 5mLチューブを使用して1×PBS溶液で2回洗浄します。
   2. 抗体希釈バッファー中のワイヤーを、5 mLチューブを使用してRTで30分間インキュベー
   トします。
   3. データシートに記載されているように、蛍光色素と結合したモノクローナル一次抗体を希釈したモノクローナル一次抗体を抗体希釈バッファーに含ませた抗体ミックス150 μLを調製します。例えば、EpCAM-FITC抗体を1:20の希釈で使用しました。
   4. p200チップを使用して、次のようにインキュベーションを行います:ワイヤーストッパーからワイヤーを取り出し、チップの大きい方の穴からワイヤーを静かに挿入します。機能していない端を最初に挿入し、金色の部分が大きな穴のすぐ後ろに来るまで、ワイヤーを小さい方の穴からゆっくりと引っ張ります。
   5. 抗体ミックス150μL(抗EpCAM_FITC抗体を1:20に希釈したものなど)をチップに静かに滴下します。気泡形成のリスクを避けるために、機能化された部分が完全に沈むまでワイヤーをゆっくりと回転させます。
   6. 先端の穴を塞ぎます。穴の周りに実験用フィルムを巻き付けると効果的です。
   7. 4°Cの暗所で一晩(~16時間)垂直にインキュベートします。
4. 免疫蛍光 2日目
   1. 1×PBSでワイヤーを2回洗浄することにより、抗体のインキュベーションをブロックします。
   2. ワイヤーをワイヤーストッパーに再度挿入します.
      手記：FISHアッセイが実行されるまで、5 mLバイアルで4°Cの1X PBSに保存してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エタノール	カルロ・エルバ	#414605
トゥイーン 20	バイオレーダー	# 1706531
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	メディカゴ	#09-9400-100
アセトン	シグマ・アルドリッチ	#534064から500ML
ゴム製セメント	ロイヤル・タレンス	# 95306500
EpCAM-FITC(クローン:HEA-125)	ミテニ	#130-080-301
RPMIの1640	ギブコ	#31870-025
XTアルクBA	MetaSystems プローブ	#D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	ギルピナノメディジン		機能化されたワイヤー
ZEISS蛍光顕微鏡Axioskop	ツァイス
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64ビットソフトウェア	ニコン
Nikon DS-QiMc 12ビットデジタルカメラ	ニコン	DS-QiMc