miRNA Extraction:血漿サンプルから miRNA を抽出する方法

要約

出典:Mensah, M. et al., MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (2017).

マイクロRNA(miRNA)は、遺伝子発現を調節する組織特異的な小さなノンコーディングRNAであり、肺がんの早期発見に理想的な候補となる可能性があります。注目のプロトコルでは、早期の肺がんスクリーニングのために、患者の血液サンプルからマイクロRNAを分離します。

プロトコル

1. 血漿サンプル採取

1. スプレーコーティングされたK₂EDTAを塗布したVacutainerチューブに10 mLの全血サンプルを採取し、室温で保存します
   手記：溶血を最小限に抑えるために、2時間以内に血漿を分離します。.非特異的なmiRNAの放出につながる熱ショックや細胞溶解を避けるために、全血を低温(4°Cなど)で保存しないでください。
2. 1時間以内に、1,258 x gおよび4°Cで10分間、最初の遠心分離ステップでプラズマを分離します。
3. 血漿上清を15mLチューブに移し、リンパ球リングとの接触を慎重に避けます。.
4. 2回目のプラズマを1,258 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
5. 1 mLの血漿を1.5 mLのクライオバイアルに分注し、チューブの基部に血漿画分が収集されないようにします。
6. 溶血の評価のための1つを除いて、すべてのアリコートを-80°Cで保存します。分子分析は5週間以内に行う必要があります。

2. 血漿トータルRNA抽出

1. ホモジナイズ溶液1 mLあたり20 μLの1-チオグリセロールを含む1-チオグリセロール/ホモジナイゼーション(OMG)溶液を調製します。1-チオグリセロールは粘性があるため、正確な測定のために慎重にピペットで移動してください。OMG溶液を使用する前に、氷上または2〜10°Cで冷やしてください><。 手記：作業溶液は、2〜10°Cで1ヶ月間安定です。
2. 凍結乾燥したDNase Iをバイアルに275 μLのヌクレアーゼフリー水を加えて懸濁し、穏やかに混合します(ボルテックスしないでください)。視覚的な補助として、再構成したDNase Iに5 μLの青色色素を加え、溶液をヌクレアーゼフリーチューブ内の使い捨てアリコートに分注します。再構成したDNase Iを-30°C〜-10°Cで保存します。
3. 200 μL の血漿から始めて、冷却した OMG 溶液 200 μL を加えます。
4. ボルテックス15-30秒で完全な均質化を確保します。泡立ちが発生した場合は、サンプルを氷上に落ち着かせます。
5. 200 μLのLysis Bufferと25 μLのProteinase Kをホモジナイズしたサンプルに加え、20秒間ボルテックスします。
6. 37°Cに予熱したサーモミキサーでサンプルを15分間インキュベー
トします。
7. 各サンプルのカートリッジを装置のデッキトレイにロードし、プラガーを適切な位置に置きます。
8. ライセートを装置カートリッジの適切な位置に移します。
9. 5 μL の DNase I 溶液をカートリッジ内の適切な位置に加えます。
10. 各溶出チューブの基部に60μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。
11. 「RSC miRNA Tissue」メソッドを選択し、自動精製ランを開始します。全RNAサンプルは-80°Cで保存できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x PBSの	ロンザ	BE-17-516
20xTE バッファー、pH 8.0	分子プローブ	T11493	20倍のストック溶液を希釈して、ヌクレアーゼフリー水の最終濃度を0.1倍にします
ヌクレアーゼフリー水
Maxwell RSC miRNA 組織キット	プロメガ	AS1460	このキットには、ホモジナイズ溶液、DNase I、プロテイナーゼK、溶解バッファー、カートリッジが含まれています。1-チオグリセロールの場合、吸入や皮膚や目との接触は避けてください。.ヒュームキャビネットの下で使用してください。
バキュテナーセーフティロック採血セット	ベクトン・ディキンソン	367286から364815
ボルテックスミキサー	ベルプサイエンティフィカ	F202A0173
サーモミキサー T-シェーカー	ユーロクローン	A00564 (英語)	RNA抽出を開始する前に、サーモミキサーを37°Cにしてください
Maxwell RSC機器	プロメガ	AS4500
極低温バイアル1.5 ml	シグマ・アルドリッチ	Z359033