免疫組織化学的染色:薄い組織切片から空間情報を取得する方法

要約

出典: Baharom F. et al., Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオでは、気管支内生検から樹状細胞を同定するための免疫組織化学的染色技術について説明しています。

プロトコル

1. GMAセクショニング。

1. 蒸留水で0.05%アンモニア溶液を調製します。ガラスナイフと生検をミクロトームに入れます。ナイフホルダーと生検ブロックの角度を調整して、ブレードがブロックの表面に対して平らになるように、生検ブロックをブレードに慎重に合わせます。
2. ミクロトームを使用して厚さ2 μmの切片を低速で切断し、鉗子を使用してアンモニア水上の切片を移し出し浮かせます。切片を45〜90秒間浮かせ、抗原の穏やかな回収と切片の展開を可能にします。
3. 顕微鏡スライドで切片をピックアップします。トルイジンブルーで迅速に染色することにより、生検の組織学を確認します。
4. 50°Cに設定したホットプレートでスライドを乾燥させ、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、ろ過したトルイジンブルーステイン500μlを切片に塗布します。ホットプレートの部分を、汚れの端に緑色のリングが現れ始めるまで温めてから、水で洗い流します。
5. 光学顕微鏡を使用して、生検の組織学を確認します。免疫組織化学に使用される切片には、損傷を受けていない固有層と上皮の良好な領域が含まれ、腺はできるだけ少なく、平滑筋はできるだけ少ない必要があります。
6. 組織型が良好な切片を切片として、ポリL-リジンコーティング(PLLコーティング)顕微鏡スライドでピックアップし、免疫組織化学染色を行います。分析のために、各生検から少なくとも2つの切片を切り取ります。スライドを少なくとも1時間乾燥させます。乾燥後、切片をスズ箔で包み、-20°Cで最大2週間保存するか、すぐに免疫染色することができます。

2. GMA埋埋入気管支内生検の免疫組織化学的染色

>注:アジ化ナトリウムは有毒です。0.1%アジ化ナトリウム溶液をヒュームフード内で酸から離して調製します。酸と接触すると有毒ガスが放出されます。

1. 先端がひし形のペンで切片を描き、スライドを染色ラックに並べます。
2. ペルオキシダーゼ ブロックを実行します。0.1%アジ化ナトリウム溶液に0.3%過酸化水素のペルオキシダーゼブロック溶液を調製します。ペルオキシダーゼブロック1 mLを切片に塗布し、30分間インキュベートします。
3. 0.05 M トリス緩衝生理食塩水(TBS)、pH 7.6 の洗浄液を調製します。TBSでスライドを5分×3回洗います。
4. DMEMで1% BSAブロック溶液を調製します。これを事前に大量に行い、必要になるまで分注して冷凍します。スライドを水気を切り、切片をブロック溶液中で30分間インキュベートして、非特異的抗体の結合をブロックします。それでも非特異的結合が発生する場合は、二次抗体と同じ種由来の5%血清ブロックを用いた30分間のインキュベーションステップを含めます。
5. TBS中の一次抗体(CD45またはCD1a)を所望の濃度(CD45を1:1,000で希釈;CD1aを1:1,00に希釈)し、スライドに塗布します。切片を覆い、RTで一晩インキュベートします。
6. TBSでスライドを3回洗います。ビオチン化二次抗体(一次抗体宿主動物種、この場合はウサギ抗マウスF(ab'₂))をTBSで所望の濃度(1:300希釈)に希釈し、スライドに適用します。RTで2時間インキュベートします。
7. 使用の少なくとも30分前にストレプトアビジンビオチン-ペルオキシダーゼ複合体を調製してください。すべてのスライドを覆うのに十分な量があることを確認してください。TBSでスライドを3回洗います。溶液をスライドに塗布し、RTで2時間インキュベートします。
8. TBSでスライドを3回洗います。3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)ペルオキシダーゼ基質溶液を調製します(製造元の指示に従って作成)。スライドに塗布し、20〜30分間、または目的の染色強度が発現するまでインキュベートします。
9. スライドを水道水で5分間洗い流し、ろ過したメイヤーのヘマトキシリン溶液で切片をカウンターステインし、水道水で5分間スライドを洗います。
10. スライドを水気を切り、切片を永久的な水性封入剤で覆います。スライドを乾燥オーブンで80°Cで乾燥させます。スライドを冷ましてから、DPXで取り付け、カバースリップを置きます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GMAセクショニング
ガラス顕微鏡スライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10143562CEFの	カットエッジ、つや消しエンド
ポリ-L-リジン溶液	シグマ・アルドリッチ	P8920-500mL	1:10 (ワーキングソリューション)
超微分切除術用のガラス板	アルカー
トゥイーン 20	シグマ・アルドリッチ	P2287	洗浄液(0.1%Tween20)
LKB 7800B ナイフメーカー	LKB
カプセルスプリッター	TAABラボラトリ	C065
炭素鋼製シングルエッジブレード	TAABラボラトリ	B054
副
アンモニア、25%	VWRの	1133.1	1 L中2 ml、1:500 (0.05%)
ミクロトーム	ライカ		ライカRM 2165
光源	ライカ		ライカ CLS 150 XE
スイングアームスタンド付き顕微鏡	ライカ		ライカMZ6
GMA免疫組織化学
ダイヤモンドペン	ヒストラブ	5218
過酸化水素30%溶液	AnalaR Normapur	23619.264
アジ化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S8032
トリス	ロシュ	10708976001
塩化ナトリウム	VWRケミカル	27810.295
ウシ血清アルブミン	ミリポア	〒82*045*2	Probumin BSA診断グレード
ダルベッコの修正イーグルミディアム (DMEMの)	シグマ・アルドリッチ	D5546
抗ヒトCD45抗体	バイオレジェンド	304002	マウスモノクローナル、クローンHI30、アイソタイプIgG1k。使用濃度500ng/ml
抗ヒトCD1a抗体AbD	セロテック	MCA80GA	マウスモノクローナル、クローンNA1/34-HLK、アイソタイプIgG2a。10 μg/mLの使用濃度
マウスモノクローナルIgG1アイソタイプ コントロール	アブカム	ab27479
マウスモノクローナルIgG2aアイソタイプ コントロール	ダコ	X094301-2
ベクタステイン ABC エリート スタンダードキット	ベクターラボ	PK-6100
AEC(3-アミノ-9-エチルカルバゾール) ペルオキシダーゼ基質カイト	ベクターラボ	SK-4200
メイヤーズヘマトキシリン	ヒストラボ	1820
永久水性マウント 中程度	AbDセロテック	BUF058C
乾燥炉
DPXパーマネントマウントソリューション	VWRの	360292Fの
光学顕微鏡	ライカ		ライカDMLB
顕微鏡カメラ	ライカ		ライカDFC 320
解析ソフトウェア	ライカ		ライカQwin V3

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