エクソソーム単離:非小細胞肺癌患者の血漿からエクソソームを分離する技術

要約

出典:Giallombardo, M., et al.非小細胞肺がん(NSCLC)患者の血漿におけるqPCRによるエキソソームmiRNA分析:実行可能なリキッドバイオプシーツール。J. Vis. Exp.(2016年)。

血漿単離されたエキソソームは、バイオマーカーの検出と追跡のための非侵襲的で再現性のある方法として使用することができます。これは、早期発見と疾患の進行のためのものです。このビデオでは、DNAおよびタンパク質の抽出に使用できる、非小細胞肺がん患者の血漿サンプルからエキソソームを分離するためのプロトコルについて説明しています。

プロトコル

1. エキソソームの分離

>注:血漿サンプルからのエキソソームの単離は、市販のキットを使用して、メーカーのプロトコルに従い、RNAse処理を追加することによって行われました（これらの手順はすべて、個人用および環境保護具を使用し、生物学的サンプルの操作に関する特定の法的手順に従って実行する必要があります)。

1. 各サンプルの血漿1 mLを-80°Cで保存し、氷上に置きます。
2. サンプルを 2,000 × g で RT で 20 分間遠心分離します。この継ぎ目は、細胞や破片を除去するために必須です。
3. きれいな血漿を含む上清を新しい1.5 mLチューブに移します。.
4. 新しいチューブを10,000 × gでRTで20分間遠心分離します。
5. きれいな血漿を含む上清を新しい1.5 mLチューブに移します。.
6. 上清に100 ng/mlのRNAseを加え、チューブを37°Cで10分間インキュベートして、循環するRNAを分解します。
7. 処理したすべての血漿を新しい 2 mL チューブに移し、0.5 容量の 1x PBS を追加します。
8. 溶液を混合するためにサンプルをボルテックスします。
9. 0.05容量のプロテイナーゼK溶液(キットに同封)をサンプルに加えます。
10. サンプルをボルテックスし、37°Cで10分間インキュベートします。
11. 0.2容量のエキソソーム沈殿バッファーをサンプルに加え、溶液を反転して混合します。
12. サンプルを2°C〜8°Cで30分間インキュベートした後、サンプルを10,000 × gで室温で5分間遠心分離します。
13. 上清を吸引して捨てます。ペレットには単離されたエキソソームが含まれています。
14. 選択したバッファーをエキソソームペレットに加えて、エキソソームを再懸濁します。バッファの選択は、計画されたダウンストリーム解析によって異なります。この場合は、次のようになります。
    1. TEM分析を行うために、1x PBSを100 μl加えます。
    2. RNA抽出用の特異的溶解バッファー346.5μl(市販キットから)を添加してください(注意:化学的危険性)。
    3. ウェスタンブロッティング分析を行うには、タンパク質抽出用の溶解バッファー100 μl(Tris-HCl 50 mM pH 7.6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0.5% - PMSF 1 mM - ロイペプチン/アプロチニン 10 μg/ml)を添加してください。(注意:化学的危険性)。
15. 再懸濁したエキソソームを-20°Cで保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
全エクソソーム単離キット(血漿から)	インビトゲン	4484450	プロテイナーゼK治療を使用する
リボヌクレアーゼA	シグマ・アルドリッチ	R4875-100MG
RNAspin Illustra ミニキット 50	GEヘルスケア	25-0500-71

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