3D DNA FISH:染色体上の特定の遺伝子を見つける技術

要約

出典:Gallerani, G. et.al. Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH. J. Vis. Exp.(2017年)。

がん患者の血液からの循環腫瘍細胞(CTC)の単離と特性評価は、非侵襲的なリキッドバイオプシーの一種であり、再発と疾患の進行に関連しています。このビデオでは、医療用ワイヤーで捕捉したCTC上のDNA蛍光in-situハイブリダイゼーション(DNA FISH)の手法について説明し、目的の特定の遺伝子を研究しています。

プロトコル

1. 3D DNA-FISH 2日目

>注意:機器の高温と湿度の高いチャンバーには特別な注意を払う必要があります。

1. ハイブリダイゼーションオーブンと乾熱オーブンをセットアップします(DNA-FISHプロトコルを開始する~3時間前)。ハイブリダイゼーションオーブンを75°Cにセットし、乾熱オーブンを37°Cにセットし、0.4×SSC溶液(pH = 7.0 ± 0.1)を4°C.
   に冷却します 手記：FISHバッファーのpHステータスは重要であり、7.0±0.1でなければなりません。
2. 氷冷した0.4×SSC溶液でワイヤーを3回洗浄します.
   手記：次の手順中に蛍光色素の光退色を避けるために、ワイヤーを暗所に置いてください。
3. ヒュームキャビネットの下の暗闇で10分間乾燥させます。
4. プローブを渦巻きにして5秒間回転させます。
5. プローブ10μLをガラスマイクロチューブに滴下します。実験用フィルムで覆います。
6. 次のようにマイクロチューブを回転させます:マイクロチューブを乾燥吸収剤で包み、紙を50mLチューブに入れ、短時間回転させます。
7. 乾燥させたワイヤーをマイクロチューブに慎重に入れ、ワイヤーストッパーを挿入します。ゴムセメントでシール.
   注意：次の 2 つのステップには、高温が関係します。保護手袋を着用してください。
8. ハイブリダイゼーションオーブンの暗く湿ったチャンバーにワイヤーを75°Cで8分間入れて、完全なDNA変性を得ます。
9. 湿ったチャンバーを37°Cの乾熱オーブンに一晩移します。

2. 3D DNA-FISH 3日目

1. 0.4× SSC溶液を入れたスライド染色ジャーをウォーターバスに入れ、72°Cに設定します。
2. 0.4× SSC溶液の温度が72°C±1°Cに達するまで確認します。
3. 2つのガラスビーカーを準備し、1つは2×SSC + 0.05%Tween(pH = 7.0 ± 0.1)溶液、もう1つは蒸留水です。
4. 湿ったチャンバーを乾熱オーブンから取り出し、ピンセットを使用してワイヤーストッパーからゴムセメントを慎重に取り除き、ワイヤーを取り出します.
   手記：コーティングされていないワイヤーの端をIN-Stopperに通し、機能化された先端を傷つけないように注意してください。
5. ワイヤーを0.4×SSC溶液に72°Cで2分間浸します。
6. ワイヤーを2×SSC + 0.05%Tween溶液でRTで30秒間洗浄します。
7. RTの蒸留水でワイヤーを洗浄します。
8. ヒュームフードの下のワイヤーを暗闇で10分間乾かします。
9. 1× PBSの2 mLに1.43 μMのDAPIストック溶液を調製します。
10. 官能基化したワイヤーの先端を2 mLバイアル中のDAPI溶液とインキュベートし、室温で暗所1時間インキュベー
トします。
11. ワイヤーを1×PBSで2回すすぎ、風乾します。

3. 3D顕微鏡観察と分析

1. ワイヤーをワイヤーホルダーに配置します。機能化された先端を、先端が結合点と一致するまで、特別なホルダーのエントリポイントに慎重に挿入します。機能化された先端を傷つけないように注意してください(図1a)。
2. 特別なホルダーを顕微鏡ステージに置きます。20×レンズを使用して顕微鏡の焦点を調整します。最初に特別なサポートに大まかに焦点を合わせ、次にDAPIチャネルで明るく見えるセルを微調整します。

結果

図1:機能化されたワイヤ、ALKブレークアパルトプローブの概略配置、ALK再配置の期待パターンのスキーム、および特別なホルダー。(a)赤いボックスは、ワイヤーの3つの主要部分(機能化チップ、ワイヤーストッパー、および非機能化チップ)を強調しています。機能化された先端はワイヤーの最もデリケートな部分であり、セルの剥離や損傷を避けるために、取り扱い中に触れてはなりません。(b)緑色と赤色のプローブは、それぞれALK遺伝子座の上流と下流の配列に結合します(左)。右側には、ALK配置の例示的なパターンが示されています。正常細胞上の赤と緑の共局在化シグナル。緑と赤のシグナルが分離されているのは、ALK遺伝子の染色体切断(ALK遺伝子の転座)と1つの緑-オレンジの共局在シグナル(異常な細胞-1)を示していま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トゥイーン 20	バイオレーダー	# 1706531
Vysis 20X SSC (66g)	アボット・モレキュラー・インク	#30-804850	推奨されているように、蒸留水に再懸濁する粉末
水	ミリポア
DAPI、フルオロピュアグレード	インビトゲン	#D21490
ZEISS蛍光顕微鏡Axioskop	ツァイス