ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織保存:組織形態の研究方法

要約

出典:Nagaraj A.S., et al., Establishing and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. J. Vis. Exp. (2018年)

次のビデオでは、ホルマリン固定とパラフィン包埋による組織の形態保存方法を説明しています。

プロトコル

1. 組織切片の固定と加工

1. 未培養の0時間基準または培養スライスをPBSに浸した濾紙に慎重に持ち上げます。
   1. これを行うには、10cmのプレートに置いた濾紙の上に2〜3mLのPBSを追加します。スライスを濾紙の上に置き、一対の鉗子を使用して濾紙を持ち上げます。
   2. 濾紙をヒストカセットに移し、希釈したヘマトキシリン(脱イオン水で1:1)を組織スライスの上に一滴加えて、後続の処理ステップでスライスの位置を視覚的にマークします(図1D)。
   3. カセットを閉じ、4%中性緩衝ホルマリン溶液に移します。ティッシュを4°C.
      で一晩固定します。 手記：スライスを濾紙の上に置くときは、スライスの上部が上を向いていることを確認してください。これは、ステップ 2.3 で説明したように、切片化および解析中にスライスの上部、中央、および下部の断面を追うために必要です。
2. 翌日、カセットを70% EtOHに移し、すぐにパラフィン包埋組織処理ステップに進みます。
3. ティッシュプロセッシングに先立ち、ヒストカゼットを100% EtOH 2xでそれぞれ10分間洗浄します。この場合、組織処理にはマイクロ波ステーションを使用してください。1 mmの組織の厚さに使用するプログラムを選択し、マニュアル(https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf)に記載されている指示に従ってください。
   手記：他のティッシュ処理機を使用する場合は、薄い組織サンプルに適したプログラムを使用してください。
4. パラフィン包埋の場合は、ヒストカセットを開き、メスを使用して濾紙からスライスを慎重に持ち上げます。濾紙を捨て、スライスを流動パラフィンの入った型に移します。
   1. 例えば、平らな重りで組織を埋め込み型の底に押し付けて、切片が均一になるようにします。ヒストカセットの底部を型の上に置き、その上に流動パラフィンを加えます。型を冷たいパテで30分間冷まし、型をパラフィンブロックから分離します
      手記：水平埋入の代替として、スライスを直立位置に配置することにより、腫瘍スライスを垂直に埋め込むことが可能です。垂直切片は、単一の切片での生存率または機能マーカー発現の勾配を容易に分析できます。水平方向に埋め込まれたスライスを使用したグラジエント分析では、ステップ 2.2 で説明したようにパラフィン切片化が必要です。

2. ホルマリン固定およびパラフィン包埋(FFPE)組織の処理と分析

1. ミクロトームを使用して、FFPE組織スライスブロックの4 μmの薄切片を調製します。セクショニングするときは、ブロックの表面がブレードに対して水平に向くようにブロックの角度を調整します。これは、組織全体の均一な切片を得るために必要である。
2. 培養によって誘発される可能性のある生存率勾配、スライス間の細胞移動、または培養スライス間のバイオマーカー発現の勾配を捕捉できるようにするには、以下で説明するように、オブジェクトスライド上の各組織スライスの最上層、中央層、および最下層から切片を収集します。
3. パラフィン包埋組織スライスの連続した組織切片を、まずスライドガラスの上部に集めます。スライドガラスの底部に続いて、中央までのより深い組織層のセクションを収集し続けます(図1E).
   手記：スライドガラス上の3つの切片を収めるには、埋め込まれた組織切片を囲む余分なパラフィンを切り取ります。
4. 切片を37°Cで一晩乾燥させ、以下に説明するようにH&E染色または免疫組織化学を行ってください
   手記：抗原性の喪失は、FFPE切片を高温または長期間保存すると発生する可能性があります。パラフィン切片は4°Cで保存することが推奨され、IHC分析は切片化後6か月以内に実施する必要があります。
   1. H&E染色では、キシレン3回で5分間、100%EtOH3回で1分間、96%EtOH2回で1分間、70%EtOH1回1分間、脱イオン水2回で1分間、パラフィン切片を脱パラフィンして再水和します。
   2. 濾過したばかりのヘマトキシリン溶液で切片を10分間インキュベートし、流水で5分間洗浄し、切片を酸性アルコール(70%EtOH中の1%HCl)に2回浸し、流水で5分間洗浄した後、0.5%エオシンと2分間インキュベートします。
   3. エオシンステップに続いて、スライドをアルコールとキシレン溶液に浸して切片を脱水します:96% EtOH 2x 15秒、100% EtOH 3x 30秒、キシレン3x 1分間。最後に、切片をキシレンベースの封入剤に埋め込みます。

結果

図1:マウスNSCLC腫瘍由来スライス外植片の確立と分析のためのワークフローの概略図。(A)スライスのための腫瘍担在肺の収集と調製を説明する概略図。マウスから肺葉を採取し、腫瘍組織を正常組織から切り離します。黒色の矢印とアスタリスクは、それぞれ約4mmおよび1mmの腫瘍を示しています。白い矢印は、検体ホルダーの表面に接着された肺組織を示しています。赤い矢印は、腫瘍を直立位置に保持するための正常な肺支持組織の追加の部分を指しています。(B)ビブラトームスライスと組織スライスの収集。白い矢印はスライス方向を示しています。シーケンシャルスライスをコールドHBSS + P/Sを含む24ウェルプレートに集めました。スライスは、培養中の腫瘍特異的マーカー発現を評価するために、異なる時点(ここでは24〜72時間)で培養するか(上段)、薬物治療...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10cm組織培養プレート	ザルシュテット	83.1802
PBSの	ロンザ	BE17-517Q
ホルムアルデヒド	漁夫	F/1501/PB08
三つ折りヒストカセット紙	がん診断	DX26280
Histoカセット	VWRの	〒720-2199
ミクロトーム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	HM355Sの
ライカ VT1200 S 振動ブレード ミクロトーム	ライカバイオシステムズ	14048142066
H&E染色用ヘマトキシリン	メルク	1.09249.0500
対比染色用ヘマトキシリン	ダコ	S3309
エオシン	シグマ	E4382
ハンクの平衡塩溶液(HBSS)	シグマ	H6648-J