膵島移植:In vivoイメージングのためのマウス眼の前房に膵島を移植する方法

要約

出典:Nilsson, J.et. al.前眼房におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞の縦断的In vivoイメージングおよび定量化。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、ヒト膵島をマウスの眼の前房に移植し、in vivoでのヒト膵島の血行再建術を監視するためのプロトコルについて説明しています。また、移植片のカプセル化と血管新生を促進する上でのレシピエント細胞とドナー細胞の寄与を理解するのにも役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJove獣医審査委員会によってレビューされています

>1. 移植機器と手術台の準備

>注:すべての手術器具はオートクレーブ滅菌し、手術台と器具は70%アルコールで消毒する必要があります。

1. 脳定位固定用ヘッドホルダーを鼻マスクを介して麻酔に接続し、加熱パッドをオンにします。
2. 気密性の高いハミルトンシリンジをポリエチレンチューブと鈍いエンドアイカニューレに接続します.
   手記：組み立てる前に、すべての部品をPBSで埋めることをお勧めします。閉じ込められた気泡を確認し、存在する場合は取り除きます。
3. ハミルトンシリンジをテーブル(図1a)または可動ベース(図1e)にしっかりと取り付け、チューブを実体顕微鏡に取り付け、カニューレを垂らします(つまり、待機位置)
   手記：サージカルテープは、取り外しや再接着が簡単なため、使用してください。
4. 0.1 mg / kgのブプレノルフィン溶液で満たされた30 G針に接続された1 mLシリンジを準備します。.
5. 滅菌PBSでシリンジを準備します。または、ピペットを使用してください。
6. 暖房ランプ付きの清潔なウェイクアップケージを取っておきます。

2. 手術用レシピエントマウスの麻酔とポジショニング

>注:すべての動物は、ルンド大学の動物施設で病原体のない環境で飼育および維持されました。

1. 40% O₂/60% N₂/3% イソフルランで満たされたチャンバーでマウスに麻酔をかけ、麻酔をかけたマウスを温かい加熱パッド上のヘッドホルダープラットフォームに移します(図1a)。ペダル反射の欠如を確認してください.
   手記：イソフルラン麻酔は、手術後の迅速な回復のための麻酔の好ましい方法です。イソフルランを使用するには、顕微鏡室を適切に換気する必要があります。
2. マウスの鼻を、40%O₂ / 60%N₂ 0.9%〜1.5%イソフルラン麻酔器に接続された麻酔マスクに入れます。親指と指を使って頭を少し持ち上げ、側面の金属片を使用して固定します。イヤピースが頭を耳の真下に固定していることを確認します。0.1 mg / kgのブプレノルフィン溶液をマウスの背中に皮下注射します。
   手記： ブプレノルフィンは鎮痛剤として使用されます。
3. 手術する目が上を向き、研究者に近づくように頭を傾
けます。
4. 移植する目のまぶたを鈍い鉗子でそっと引っ込め、目をぽっかりと出し、ピンセットでゆるく固定します。ピンセットの先端がヘッドホルダープラットフォームに取り付けられたポリエチレンチューブで覆われていることを確認してください(図1a、挿入図)。
5. 滅菌PBSの液滴を目に塗布して、常に両目を濡らしてください。
6. 密封された1.5 mLチューブ(セクション1)からヒト膵島を滅菌PBS入りのペトリ皿に移し、膵島が互いに接近していることを確認します。これにより、細胞培養培地の移管量が最小限に抑えられます(図1c)。
7. ポリエチレンチューブを介してハミルトンシリンジに接続されたアイカニューレで~20〜30の膵島をピックアップします.
   手記： 小島と一緒に液体をできるだけ取り込まないようにします。
8. チューブを逆さまに吊るし、実体顕微鏡に取り付けます(図1d)。チューブを慎重にテープで固定して、膵島がチューブの端に沈み、カニューレに向かって沈むようにします。

>3. 移植の手順

>注:この方法は、マウス膵島の移植について以前に説明されています。ここでは、少し変更された手順を示します。

1. 後ろ足のパッドをつまんで、マウスがスリープ状態であることを確認します。
2. 血流を乱さずに目を拘束する鉗子を締め、滅菌PBSの液滴を目に塗布します。
3. 25Gの針をメスに見立てて上向きに面取り、角膜の先端の半分だけ丁寧に貫通し、横方向に1回切開します。上向きの角度で穴を開けます。移植後、穴はより簡単に塞がれます(図1F)。
4. 膵島があらかじめ装填されたカニューレで角膜を慎重に持ち上げ、ゆっくりと目に膵島を当てます。虹彩の損傷を防ぐために、カニューレを前房に挿入することは避け、角膜の開口部を慎重に押します(図1g)。カニューレをACEからゆっくりと引っ込めます。
   手記：注入量は3〜8μLを目安にしてください。容量が大きすぎると、目が不必要に高い眼圧にさらされ、注入された膵島が前房から逆流する可能性があります。.
5. 眼室内の圧力が上昇して膵島挿入が困難になった場合は、横切開部位を補強して切開部位を拡大し、膵島を再適用します
   手記：時折、導入された気泡をスペースホルダーとして使用できます。
6. アイジェルを目に塗布し、眼を拘束する鉗子を緩め、マウスをイソフルラン上に8〜10分間同じ位置に置いて、膵島を固定します。
7. まぶたを固定している鉗子を取り外し、まぶたを通常の位置に戻します。
8. マウスをヘッドホルダーから取り外し、ウェイクアップケージに移します。
9. マウスが目を覚まし、動いているときは、マウスを元のケージに戻し、スキャンするまで動物飼育室に保管します(少なくとも5日間を推奨)。

結果

図1:眼の前房への膵島の移植。
(a)定位固定装置ヘッドホルダーに固定された麻酔マウスと、テーブルに固定された準備されたハミルトン注射器の隣に露出した目(挿入図)を示す移植セットアップと、マウスの島(b)または人間の島(c)を選択する準備ができている実体顕微鏡。(d)膵島が装填されたアイカニューレの待機位置。(e)進行中の移植、および(f)アイカニューレの先端で角膜を慎重に持ち上げ、膵島を前房(g)に分配するために使用される単一の側方切開の概略図。マウス膵島(h)またはヒト膵島(i)の注射直後の眼の画像。スケールバー = 500 μm.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
クリーンベンチコート
ヒーティングパッド			37°Cに設定
Ivis Lumina ll 生物発光イメージャー	キャリパー		その他の生物発光イメージングシステムには、In vivo F PRO(Carestream)およびPhoton Imager(Biospace Lab)が含まれます
解剖ハサミ
虹彩鉗子(鋸歯状)
ニードルホルダー
27 G 0.3 mlインスリン注射器	テルモ	T35525M2913