オルガノイドエレクトロポレーション:プラスミドDNAを消化管オルガノイドにトランスフェクションする方法

要約

出典:Gaebler, A. M.et al.消化器オルガノイドの遺伝子工学のための普遍的で効率的なエレクトロポレーションプロトコル。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、膵管腺癌(PDAC)、結腸直腸癌(CRC)、胆管癌(CCC)、胃癌(GC)オルガノイドなど、さまざまなエンティティでその普遍的な機能を証明するために、大きなプラスミドを三次元胃腸オルガノイドにトランスフェクションするためのエレクトロポレーションプロトコルについて説明しています。

プロトコル

1. エレクトロポレーション前のオルガノイド培養と調製

1. 前述のように組織消化によってオルガノイドを樹立し、地下マトリックス中の対応するエンティティ特異的培養培地でそれらを増殖させる 概要:表1および材料表を参照
   手記：ヒト組織サンプルの場合、インフォームドコンセントと倫理委員会による研究の承認が必要です。
2. エレクトロポレーション後の播種のために、37°Cで48ウェルプレートを予温します。
3. 10 μM Y-27632 および 3 μM CHIR99021.
   を含む、抗生物質を含まない基礎培地、および抗生物質を含まないエンティティ特異的オルガノイド培地(表 1 を参照)を調製します。 手記：抗生物質の離脱は、毒性作用を減らすために重要です。Y-27632とCHIR99021細胞の回復を改善します。
4. オルガノイドの調製(図1を参照)
   1. 培地中のエレクトロポレーションサンプルごとに48ウェルプレートでオルガノイドの5ウェルを培養します.
      手記：増殖性オルガノイドを使用する必要があります(最後の分裂から約2〜3日後)。
   2. ウェルあたり10 μM Y-27632を含む230 μLの解離試薬(材料表を参照)を調製します。
   3. 各ウェルから培地を取り出し、調製した解離混合物230μLでオルガノイドを機械的に解離します。エレクトロポレーションサンプルごとに5つのウェルを1つの15 mLチューブにプールします。
   4. ボルテックスで混合し、10〜15個の細胞のクラスターが発生するまで、37°Cで5〜15分間インキュベートします。したがって、解離を顕微鏡で確認してください。抗生物質を含まない基礎培地を最大10mLまで追加して消化を停止します.
      手記：このステップは非常に重要です。インキュベーションが短すぎるとエレクトロポレーションの効率が低下しますが、消化が長すぎると生存率が低下します。
   5. 450 x g で室温で 5 分間遠心分離し、上清を捨てて 4 mL のエレクトロポレーションバッファーで 2 回洗浄します(材料の表を参照)。

>2. エレクトロポレーション

>注:次のプロトコルは、矩形波と分離されたポアリングおよび伝達パルスシーケンスが可能なエレクトロポレーター用に開発されました(図2を参照)。オプションで、インピーダンス値、およびサンプルに伝達される電圧、電流、エネルギーを、再現性のある実験の制御として測定できます。

1. オルガノイドペレットを、30 μgのプラスミドDNAを含む100 μLのエレクトロポレーションバッファー(材料表を参照)に再懸濁します><。 手記：エレクトロポレーションプロセス中の最適な塩濃度を得るためには、使用するプラスミドDNAの濃度が5 μg/μLを超える必要があります。したがって、ベクターの調製には、エンドフリープラスミドマキシキット(材料表を参照)が推奨されます。合計45μgまでのDNAを細胞毒性なく使用できます。
2. 完全なDNA-オルガノイド混合物を、気泡を発生させることなく、ギャップ幅2mmのエレクトロポレーションキュベットに分注します。
3. エレクトロポレーションパラメータを設定します(表2、図2を参照)。
4. キュベットを指で軽くたたいて、泡立たないように細胞をわずかに混合します。キュベットをキュベットチャンバーに入れます。
5. エレクトロポレーターのΩボタンを押して、インピーダンス値をメモします.
   手記：インピーダンスが30〜40 Ωの場合、最良の結果が得られました。一般に、30〜55 Ωの範囲である必要があります。そうでない場合は、使用するキュベットのギャップ幅、エレクトロポレーターのケーブル接続、気泡の可能性、エレクトロポレーション混合物の正しい量と塩濃度を制御してください。
6. スタートボタンを押してエレクトロポレーションプログラムを実行し、表示される電流、電圧、エネルギーの値を制御します。
   手記：測定された電圧、電流、エネルギーの値は、設定されたエレクトロポレーションパラメータに対応している必要があります。繰り返し実験を比較する際には、これらのデータに注意すると役立ちます。
7. エレクトロポレーション後、直ちに抗生物質を含まない500 μLの培地(CHIR99021およびY-27632を含む、ステップ1.3を参照)を加えます。ピペッティングで上下に動かして混合し、白い泡を解離します.
   手記：エレクトロポレーションプロセスの後に白い泡が現れ、かなりの数の細胞がそれに付着します。ですから、細胞を失わないようにするためには、その解離が非常に重要です。
8. エレクトロポレーションキュベットに属するピペットを使用して、サンプルをキュベットから新しい15 mLチューブに完全に移します(材料の表を参照)。残りの細胞を得るために、キュベットを基礎培地で再度すすぐことをお勧めします。
9. 細胞の再生のために、室温で40分間インキュベー
トします。

3. 細胞の播種

1. 細胞を450 x gで室温で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
2. ペレットを100 μLのベースメントマトリックスに再懸濁し、予熱した48ウェルプレートに20 μL滴を播種します(ステップ1.2を参照)。重合のために37°Cで10分間インキュベートし、Y-27632を添加した250μLの培地を加え、成長したオルガノイドの次の分裂までCHIR99021します(約5〜7日)。

4. トランスフェクション効率の決定

>注:一般的に、追加のトランスフェクション制御として蛍光マーカーを運ぶベクターをエレクトロポレートすることが推奨されます。選択されたマーカーおよびその発色団の成熟度に応じて、蛍光はトランスフェクション後約24〜48時間以内に見えるようになる18。

1. トランスフェクションコントロールで24〜48時間後に蛍光を顕微鏡で確認します(図3B)

>表1:基礎培地、消化混合物、培養培地の組成。

基礎培地コンポーネント:	私	II.
アドバンスドDMEM/F-12	-	-
グルタマックス	1倍	1倍
ヘペス	10 mM	10 mM
ペニシリンストレプトマイシン	-	1倍
プリモシン	1倍	-

の の

>消化による確立
消化ミックス:	コロン		胃		肝臓		膵臓
	正常	腫瘍性	正常	腫瘍性	正常	腫瘍性	正常	腫瘍性
コラゲナーゼII	-	-	-	-	-		0.625 mg/ml
コラゲナーゼXI	-	0.1 mg / ml	-	0.1 mg / ml	-		-
コラゲナーゼD	-	-	-	-	2.5 mg/ml		-
ディスパーゼII	-	1 mg / ml	-	1 mg / ml	-		2.5 mg/ml
DNase I	-	-	-	-	0.1 mg/ml		-
EDTAの	2mM	-	10mM	-	-		-
希釈	キレートバッファー*	基礎培地I	キレートバッファー*	基礎培地I	EBSSで		基底中I.
インキュベーション:	氷上で0.5時間	37°Cで1時間	常温で0.25-0.5時間	37°Cで1時間	37°Cで0.5-1時間	37°Cで1.5時間	37°Cで0.5-1	37°Cで2〜3時間
参照から適応:	佐藤ら 2011		Bartfeld et al. 2015		Broutier et al. 2016		Hennig et al. 2019

さん の

>栽培培地(基本:基礎培地II.)
A83-01	0.5 μM	2 μM	5 μM	0.5 μM
B27	1倍	1倍	1倍	1x
ビタミンAを含まないB27	-	-	1倍	-
フォルスコリン	-	-	10 μM	-
hFGF-10	-	200 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml
hHGFの	-	-	25 ng/ml	-
[Leu15] ガストリン	10 nM	1 nM	10 nM	10 nM
mEGFの	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml
N2	-	-	1倍	-	1倍
N-アセチル-L-システイン	1.25 mM	1 mM	1 mM	1 mM
ニコチンアミド	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
頭	10 %	10 %	-	10 %
プリモシン	1回(100μg/ml)	1回(100μg/ml)	1回(100μg/ml)	1x (100 μg/ml)
プロスタグランジンE2	10 nM	-	-	-	1 μM
ルスポンディン	20 パーセント	10 %	10 %	10 %
SB202190	3μM	-	-	-
Wnt3Aの	50 %	50 %	-	50 %
*キレート緩衝液:5.6 mM Na2HPO4、8.0 mM KH2PO4、96.2 mM NaCl、1.6 mM KCl、43.4 mMスクロース、54.9 mM d-ソルビトール、0.5 mM dl-ジチオスレイトール、蒸留水中

結果

図1:エレクトロポレーション調製ワークフロー。まず、オルガノイドは10〜15個の細胞のクラスターに解離し、抗生物質は洗い流されるべきです。エレクトロポレーション後、白いフォームを解離する必要があります。細胞は、室温で40分間再生した後、播種することができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
[Leu15] ガストリン	シグマ・アルドリッチ	G9145
A83-01	トクリス・バイオサイエンス	2939
アドバンスドDMEM/F-12	インビトゲン	12634010
B27	インビトゲン	17504044
ビタミンB27サプリメント、ビタミンAを除いたもの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12587010
CHIR99021	ステムジェント	2004年04月
コラゲナーゼII	ライフテクノロジー	17101-015
コラゲナーゼXI	シグマ・アルドリッチ	C9407-100MG
コラゲナーゼD	ロシュ	11088866001
ディスパーゼII	ロシュ	4942078001
DNアーゼI	シグマ・アルドリッチ	D5319
D-ソルビトール	ロス	6213.1
ジチオスレイトール	サーモサイエンティフィック	1859330
EDTAの	ロス	8040
フォルスコリン	トクリス・バイオサイエンス	1099名
グルタマックス	ライフテクノロジー	35050061
ヘペス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630106
hFGF-10	プレプロテック	100〜26
KClの	シグマ・アルドリッチ	P9541
KH2PO4	ロス	3904.2
マトリゲル	コーニング	356231	地下室マトリックス
mEGFの	インビトゲン	PMG8043
N2	インビトゲン	17502048
NaCl	ロス	3957.1
Na2HPO4	ロス	K300.2
N-アセチル-L-システイン	シグマ・アルドリッチ	A9165の
ニコチンアミド	シグマ・アルドリッチ	N0636
頭	N.A.	N.A.	HEK293細胞から作製した馴化培地(Hek293-mNoggin-Fc)
組換えヒトHGF	プレプロテック	100-39H
ルスポンディン	N.A.	N.A.	HEK293細胞から作製した馴化培地(HA-Rspo1- Fc-293T)
SB202190	シグマ・アルドリッチ	S7067
TrypLEエクスプレス	ギブコ	12604021	解離試薬
Wnt3Aの	N.A.	N.A.	L-Wnt3a細胞から作製した馴化培地(Sylvia Boj社製)
Y-27632	シグマ・アルドリッチ	0503年度
48ウェルプレート	コーニング	3548
Nepa エレクトロポレーションキュベット 2mmギャップ ピペット付	ネパジーン(株)	EC-002S
エレクトロポレーター Nepa21	ネパジーン(株)	N.A.
EVOS FLオート	インビトゲン	AMAFD1000	蛍光顕微鏡
EndoFreeプラスミド Maxi Ki	キアゲン	12362
オプティMEM	ギブコ	31985047	エレクトロポレーションバッファー
2 gRNAコンカテマーベクター	AddGene(アドジーン)	84879
PX458プラスミド	AddGene(アドジーン)	48138	sgRNAおよびCas9のコーディング
px458_Conc2プラスミド	AddGene(アドジーン)	134449	px458 プラスミドには、2 つの異なる sgRNA 用の 2x U6 プロモーターが含まれています

の 名 さん の 型 の の さん 名