膵臓腫瘍におけるex vivo T細胞刺激:T細胞におけるサイトカイン産生を増加させる方法

要約

出典:Spear, S., et al.同所性膵臓腫瘍の生成と腫瘍浸潤性T細胞の細胞毒性のex vivo特性評価。J. Vis. Exp.(2019年)。

この記事では、インターフェロンガンマやIFN-ガンマなどのサイトカインや腫瘍壊死因子アルファまたはTNF-αなどのT細胞内の細胞内濃度を増加させるためのex vivo T細胞刺激の技術について説明しています。これらのサイトカインは、効果的な抗腫瘍反応を媒介し、腫瘍において治療的役割を果たすことができます。

プロトコル

1. 膵臓腫瘍の消化

1. 解剖した膵臓腫瘍、転移性腫瘍、または健康な膵臓組織を氷冷PBSに入れ、氷上に保管します。
   1. 鉗子を使用して腫瘍をペトリ皿に移します。
   2. 50 mL チューブに 5.0 mL の消化培地(2 mg/mL Collagenase、0.025 mg/mL DNase RPMI)を加え、酵素活性が始まらないように氷上に保存します。
      手記：このプロトコルは、≥1 単位/mg の FALGPA と > 125 コラーゲン消化単位 (CDU)/mg 固体の活性を持つコラゲナーゼ V 型を使用します。コラゲナーゼおよびDNaseアリコートは、-20°Cで保存し、氷上で解凍してから使用できます。両方が滅菌RPMIで完全に可溶化されたら、0.2μmフィルターに通して汚染物質を除去できます。コラゲナーゼは、材料の損失を避けるために、ろ過する前に完全に可溶化する必要があります。
   3. この溶液の少量のアリコートを取り、ペトリ皿の腫瘍を覆います。
   4. 滅菌メスと鉗子を使用して、腫瘍を長さが約3mm未満の小片に切ります。
   5. 腫瘍片をチューブにこすり落とし、すべてのピースが消化媒体に沈むまでチューブを静かに反転させます。他の腫瘍サンプルをバッチで調製する必要がある場合は、氷上に保存します。
   6. 37°Cで20分間振とう装置に移し、腫瘍のすべての部分が水没し、チューブの端にくっつかないことを確認します。振とうができない場合は、5分ごとにサンプルをボルテックスして分解を助けます。

2. 消化された腫瘍からの単一細胞懸濁液の調製

1. 消化ステップの直後に、チューブを氷の上に置いて酵素の活性を遅らせます。
   1. EDTAを添加して最終濃度を20 mMにし、サンプルを短時間ボルテックスして混合します。これにより、酵素の活性がさらに遅くなります。
   2. チューブを開き、チューブの蓋から腫瘍消化物を新鮮なRPMI培地で洗い流します。
   3. 70 μmのストレーナ(ストレーナーのμmサイズは必要に応じて変更できます)を50 mLのオープンチューブ上に氷上に調製します。
   4. フィルターをメディウムで事前に濡らします。
   5. 消化した細胞を再懸濁し、25 mL以上のストリケットを使用してチューブの側面を洗浄します。ストリペットの開口部が広いことは、濃厚なダイジェストを通過させるために重要です。
   6. 25mLのストリペットを使用して、すべての消化物をストレーナーに移します。
   7. 1mLシリンジプランジャーを使用して、フィルターの上部に腫瘍をつぶします。直接上下にだけマッシュして、セルへのせん断応力を最小限に抑えます。
   8. RPMIを使用して、ストレーナーを通して細胞を連続的に洗浄します。細胞を押し通すのに十分な力で洗うようにしてください。
   9. マッシュする材料がまだあるにもかかわらず、RPMIがフラッシングを停止すると、ストレーナは飽和状態になります。したがって、サンプルを新しいフィルターに移して続行します.
      手記：最終的には、細胞外マトリックス成分のみがフィルターに残り、すべての単一細胞が通過しているはずです。
2. チューブを300 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
   1. 細胞ペレットを完全なRPMIで慎重に再懸濁し、別のフィルターを直接通過させて、適切に再懸濁できない細胞外マトリックスまたは大きな細胞塊を除去します。
   2. この時点で刺激が不要な場合は、プレートを300 x g、4°Cで5分間遠心分離し、フローサイトメトリー分析のために単離された細胞をすぐに染色します。プレートを逆さまにフリックして上清を1回の鋭い動きで取り除きます。あるいは、凍結培地(FBS中の10%DMSO)に再懸濁し、-80°Cで保存した後、液体窒素で長期保存します
      手記：凍結ステップにより、後日免疫細胞を精製することができます。ただし、免疫細胞サブセットの定量には、細胞数と表現型が凍結融解プロセスの影響を受けないことを確認するための最適化が必要になる場合があります。ex vivo T細胞刺激は、新鮮な腫瘍サンプルで最もよく実行されます。この時点で、サンプルは、必要に応じてビーズベースの死細胞除去または免疫細胞濃縮アッセイによってさらに精製できます。

3. ex vivo刺激のための細胞の準備

1. 細胞をカウントして、完全培地(RPMI 10 % FBS、1X ペニシリン、1X ストレプトマイシン)で 2 x 10⁶/ 100 μL の濃度を達成します。
   手記：プレーティングされた総細胞数が多いため、このサンプル内に分析するのに十分なT細胞が存在することが保証されます。ただし、サンプルの入手可能性や、関心のあるT細胞サブセットの希少性に応じて、数を拡大または縮小することができます。
   1. U底の96ウェルプレートに100μLの細胞をプレートします。
   2. PMA/イオノマイシンの2倍調製物を含む100 μLの完全培地を添加します(メーカーが推奨する最終濃度をそれぞれ0.081 μMおよび1.34 μMに達成するため)
      手記：脱顆粒/エキソサイトーシスを測定する場合は、蛍光標識抗マウスCD107aもここに含めてください。CD107aを含まない対照サンプルも実施する必要があります。
   3. 5% CO₂を入れた37°Cインキュベーターに1時間置く。
   4. ブレフェルジンAとモネンシンの10倍調製物20μLを添加します(最終濃度はそれぞれ1.06 μM、メーカー推奨)
      手記：ブレフェルジンAおよびモネンシンはタンパク質輸送阻害剤であり、サイトカインなどの細胞外放出を阻害し、フローサイトメトリーによる検出を可能にします。ELISAまたは同様の方法で上清へのサイトカイン放出を測定する場合、このステップはスキップできます。
   5. プレートを5%_CO2を入れた37°Cのインキュベーターにさらに4時間置きます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
70μm細孔径セルストレーナー	フィッシャーサイエンティフィック	11597522
抗CD107a PE(クローン1D4B)	バイオレジェンド	121612	1:100 から culture media
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A4503の
細胞刺激カクテル(500x)(ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)およびイオノマイシン)	eバイオサイエンス	00-4970-03	x 最終濃度 PMA 0.081 μM、イオノマイシン 1.34 μM
THP1ヒト単球性白血病細胞	ATCCの	TIB-202
Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼV型	シグマ・アルドリッチ	C9263	2 mg/mL 培地中
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	D2650-100mL
DNase(ウシ膵臓II-S型由来のデオキシリボヌクレアーゼI)0.15 M NaCl中に10 mg/mLを保存	シグマ・アルドリッチ	D4513	消化培地中の最終濃度 0.025 mg/mL
胎児子牛血清(FCS)	GEヘルスケア	A15-104	RPMIで10%
ハミルトンシリンジ700シリーズ、容量25μL、22sゲージニードルベベルチップ	フィッシャーサイエンティフィック	10100332
ペニシリン/ストレプトマイシン	PAAの	15140122	100ユニット/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン
タンパク質輸送阻害剤カクテル(500x)(ブレフェルジンAおよびモネシン)	eバイオサイエンス	00-4980-03	1x 最終濃度 ブレフェルジン A 10.6 μM、モネンシン 2 μM
RPMI-1640(グルタミン0.3g/L含有)	シグマ・アルドリッチ	R8758
外科用メスブレード No.10	スワン・モートン	501
トリプシン-EDTA溶液10倍	シグマ・アルドリッチ	594-18C	トリプシン(0.1%)EDTA(0.4%)最終濃度
U底96マイクロウェルプレート	VWRの	〒734-2080

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