膵臓細胞におけるカルシウム動態のイメージング:膵島における細胞質カルシウム濃度のリアルタイム変化を研究する技術

要約

出典:Hamilton, A., et. al. マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウム動態のイメージング。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、膵島細胞のマイナーな亜集団における細胞質カルシウム濃度の変化を研究するために、リアルタイムで膵島細胞をイメージングする技術について説明しています。マイナー細胞亜集団は、アドレナリンやグレリンなどのマーカー化合物に対する機能的応答を使用して同定でき、膵島細胞の特定の集団で細胞質カルシウムの変化を誘導します。これにより、血糖値と膵島の分泌物出力との間のクロストークに関する洞察を得ることができます。

プロトコル

1. 染料をロードするか、センサーを発現させます

1. トラップ可能な染料を準備します。
   1. トラップ可能な色素(Fluo-4など)のアリコート(通常は50μg)をDMSOに溶解し、ストック濃度を2 mMにします。プルロン酸を最終濃度1%まで添加し(DMSOに20%のストックを使用)、色素の可溶化を改善します。
   2. 小さなPCRチューブ(それぞれに2 μL)で色素を分注します。染料は冷凍(-20°C)で数週間保存できます。
2. または、組換えセンサーを準備します。
   1. センサー(GCaMP6fをコードするアデノウイルスベクターなど)を10μLアリコートに分配し、-80°Cで保存します。
   2. (オプション)いくつかの段階希釈液を使用して膵島(下記参照)に感染させることにより、ウイルスストックの力価を事前にテストし、感染に最適な濃度を明らかにします。
      手記：異なるベクター(レンチウイルス、BacMam、AAV)によってコードされた組換えセンサーには、異なる感染プロトコルが必要です。これをベクタープロバイダーに確認し、ニーズに合わせて作業比を最適化してください。アデノウイルスの「作動」ストックは、-20°Cで保存し、数回凍結/解凍することができます。過度の凍結融解サイクルは、ウイルスの実効力価を低下させます。
3. イメージングソリューションを準備します。
   1. イメージング溶液、mM:140 NaCl、4.6 KCl、2.6 CaCl₂、1.2 MgCl₂、1 NaH₂PO₄、5 NaHCO₃、10 HEPES(pH 7.4、NaOHを含む)を構成します。
   2. イメージング溶液中にグルコース(0.5 M)とマンニトール(0.5 M)のストックを調製します。ストックは冷蔵庫(4°C)で数週間保存できます。
4. トラップ可能な染料をロードします。
   1. 2 μLの色素を6 mMグルコースを含む600 μLのイメージング溶液に溶解して、色素ワーキング溶液を調製します。溶液を加熱またはボルテックスして、可溶化を改善することができます。
   2. 分離された膵島を染料の作業溶液にロードします。ローディングは、マルチウェルプレートまたはペトリ皿を使用して行うことができます。後者の場合、非粘着性のペトリ皿(35mmまたは60mm)の底に100μLの液滴を入れ、10〜30個の小島を液滴にピペットで移します。
   3. 膵島のグループが異なる場合(例:野生型/ノックアウト型)、複数のウェルと複数の液滴を配置して、ローディングを同時に行えるようにします。
   4. 膵島を染料作業溶液中で室温で暗闇で70〜90分間インキュベートします。過度にインキュベートしないでください。
   5. 蛍光顕微鏡で負荷量を確認します。膵島は穏やかな蛍光を発し、一部の細胞は他の細胞よりも明るくなります。細胞の丸めと色素の核局在は、過負荷の兆候です。
   6. 膵島を6 mMグルコースを含む色素フリーイメージング溶液に移します。膵島はすぐにイメージングに使用できますが、オプションで色素をさらに10〜15分間脱エステル化するために放置することができます。膵島は色素を数時間保持するため、数回のシフトでイメージングに使用できます。
5. あるいは、膵島に組換えベクターを感染させます。
   1. RPMI培養培地(RMPI1640(材料の表を参照)で膵島を液滴でプレート化し、ウシ胎児血清10%、ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/mLを補充します。培地を2つの60mmプラスチックシャーレ(接着剤で処理されていない)に分注し、ディッシュをインキュベーター(37°C、5%CO₂、絶対湿度))に保管します。(例:30 μL)、必要なベクターの量を最小限に抑えます。
   2. ベクターを約10⁵感染ユニット/膵島の比率で追加し、理想的には感染の多様性をもたらすはずです>2。理想的には、比は、周辺層で発現を提供する最小比に最適化する必要があります。予備滴定(ステップ1.2.2)が役立つ場合があります。
   3. 20〜50個の小島を液滴に導入し、8〜48時間培養します。(理想的には、一晩中)。膵島は、細胞の形態に変化を生じさせることなく、ほとんどの細胞でかすかな緑色の蛍光を発するはずです
      手記：感染および発現の成功は、ウイルス溶液への曝露時間に依存する。理想的には、ウイルスは溶液中に一晩留まるべきですが、わずか15分後にオプションで除去することができます。しかし、感染力、つまり発現力は劇的に低くなる可能性があります。

2. イメージング Ca²⁺ ダイナミクス

1. (倒立)顕微鏡の下で膵島を固定します。
   1. 倒立顕微鏡用のイメージングチャンバーを組み立てます。ガラスカバースリップ(厚さ1または1.5)をチャンバー内に配置して、ガラスとチャンバーのインターフェースが防水であることを確認します。カバーガラスが顕微鏡対物レンズの手の届くところにあることを確認します(かさばる高NA対物レンズの場合に重要です)。
   2. 固定アクセサリーを準備します。細かいメッシュと粗いメッシュから小さな長方形(20 mm x 20 mm)を切り取ります。厚さ45〜50μmの粘着テープを使用して、細かいメッシュに2つのスペーサー「壁」を挿入します。撮像する島の大きさが従来の100μmを大幅に超える場合は、スペーサーを二重層にしてください。
   3. メッシュとウェイトを35mmのシャーレを使用してイメージング溶液に浸します。プラスチックと金属が濡れていることを確認してください。
   4. 解剖顕微鏡下で、スペーサーの「壁」を逆さまにし、スペーサーを上に向けて細かいメッシュを回します。トラップ可能な色素を充填した島、またはP20ピペットで組換えセンサーを発現させたいくつかの島を選び、2つのスペーサーの間の細かいメッシュの上に静かに配置します。メッシュとワッシャーに過剰な量のイメージング溶液が含まれていないことを確認してください。
   5. 時計職人の鉗子を使用して、膵島とメッシュを拾い上げ、イメージングチャンバー内で逆さまに配置し、スペーサーが下を向いてチャンバーカバースリップに直接座るようにします。膵島がスペーサーとメッシュの間に、カバースリップの中央に閉じ込め
   られていることを確認します。
   6. 粗いメッシュとウェイトをチャンバー内の細かいメッシュの上に配置します。イメージング溶液をチャンバーに導入します。小島が固定され、画像化の準備ができていることを確認します。チャンバーを過度に振ることは避けてください(チャンバーを顕微鏡に運んだり、加熱ステージに挿入したりするような小さな摂動は許容されます).
      手記：同様の固定配置は、直立システムにも適用できます。
2. 顕微鏡をセットアップします。
   1. イメージングモードと対物レンズを選択し、ステップ2.1の膵島のあるチャンバーを顕微鏡の温度制御ステージに配置します。
      1. 温度制御(理想的には30°Cから36°Cの間)と灌流を設定します。倒立システムの場合は、チャンバ内の流入流を流出よりも低く配置し、流出フラックスを流入フラックスよりも大きく設定します(これは通常、ペリスタルティックポンプでより広い内径のチューブを使用して達成されます)。
      2. 流出物が溶液との接触面が最小限であることを確認し、複数の連続した小さな液滴で溶液を除去し、長時間の連続的な溶液除去を回避します。後者は、周期的な信号のタイムラプスイメージングにおけるアーティファクトの主要な原因であり、それらは画像化されたすべてのピクセルの規則的な周期的な強度振動として現れ、しばしば「遅い波」と解釈されます。
      3. 3 mMグルコースを含むイメージング溶液で灌流を開始します。
   2. 緑色の蛍光色素のイメージングには、光路とフィルターを選択してください。励起は470〜500、発光は505〜550で、それぞれに有効です。
   3. ライブイメージングを実行して、イメージングパラメータを設定します。ビューを調整して、目的の小島をキャプチャします。
   4. 画像の S/N 比を最適化します。そのためには、励起光の強度、露光時間、ビニングを調整します。設定により、小島内の各セルが可能な限り最小限の光強度と露出で明確に視覚化できることを確認します。
   5. 画像取得を実行します。タスクにもよりますが、0.1〜5Hzで画像を撮影できます。これは、αセルとδセル(>300Hz)の高速Na⁺駆動振動のナイキスト基準をはるかに下回っており、データはデフォルトでアンダーサンプリングされています。しかし、この要求に合わせて取得頻度を上げることは、広い視野を持つマルチセル/マルチアイランドイメージングでは実現できません。GCaMPはより高速にイメージングできますが、Fluo4は高速取得条件下では必然的に漂白します.
      手記：膵島細胞の[Ca²⁺]_cyt振動が電気的活動によって駆動されることを考えると、低い捕捉率を使用することは逆効果に聞こえるかもしれません。しかし、実際には、β細胞のスパイク挙動を解決するには、約1 Hz以上の取得レートで十分な場合がありますが、α細胞およびδ細胞のナトリウムチャネル駆動振動の検出しきい値は300 Hzをはるかに超えています。α細胞またはδ細胞のCa²⁺_細胞振動が1 Hzまたは0.1 Hzで取得されるかどうかにかかわらず、それらは大幅にアンダーサンプリングされ、電気的活動ではなく細胞によるCa²⁺の取り扱いを反映します。
      1. 取得したデータの品質を確認してください:3 mMのグルコースでは、α細胞の活性がはっきりと見える/検出可能である必要があります。これが当てはまることを確認し、フルスケールのタイムラプスイメージングに進みます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
40倍/1.3対物レンズ
GCaMP6f、in (ヒト5型)アデノウイルスベクター	ベクターバイオラボ	1910
ウシ胎児血清	シグマ・アルドリッチ	F7524-500ミリリットル
RPMIミディアム	サーモフィッシャー(GibCo、Life Technologies)	61870044
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー(GibCo、Life Technologies)	15140122
Axiovert 200顕微鏡
フルオ4	サーモフィッシャー(ライフテクノロジーズ)	F14201

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