膵臓細胞におけるカルシウム動態のイメージング:膵島における細胞質カルシウム濃度のリアルタイム変化を研究する技術

要約

出典:Hamilton, A., et. al. マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウム動態のイメージング。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、膵島細胞のマイナーな亜集団における細胞質カルシウム濃度の変化を研究するために、リアルタイムで膵島細胞をイメージングする技術について説明しています。マイナー細胞亜集団は、アドレナリンやグレリンなどのマーカー化合物に対する機能的応答を使用して同定でき、膵島細胞の特定の集団で細胞質カルシウムの変化を誘導します。これにより、血糖値と膵島の分泌物出力との間のクロストークに関する洞察を得ることができます。

プロトコル

1. 染料をロードするか、センサーを発現させます

1. トラップ可能な染料を準備します。
   1. トラップ可能な色素(Fluo-4など)のアリコート(通常は50μg)をDMSOに溶解し、ストック濃度を2 mMにします。プルロン酸を最終濃度1%まで添加し(DMSOに20%のストックを使用)、色素の可溶化を改善します。
   2. 小さなPCRチューブ(それぞれに2 μL)で色素を分注します。染料は冷凍(-20°C)で数週間保存できます。
2. または、組換えセンサーを準備します。
   1. センサー(GCaMP6fをコードするアデノウイルスベクターなど)を10μLアリコートに分配し、-80°Cで保存します。
   2. (オプション)いくつかの段階希釈液を使用して膵島(下記参照)に感染させることにより、ウイルスストックの力価を事前にテストし、感染に最適な濃度を明らかにします。
      手記：異なるベクター(レンチウイルス、BacMam、AAV)によってコードされた組換えセンサーには、異なる感染プロトコルが必要です。これをベクタープロバイダーに確認し、ニーズに合わせて作業比を最適化してください。アデノウイルスの「作動」ストックは、-20°Cで保存し、数回凍結/解凍することができます。過度の凍結融解サイクルは、ウイルスの実効力価を低下させます。
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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
40倍/1.3対物レンズ
GCaMP6f、in (ヒト5型)アデノウイルスベクター	ベクターバイオラボ	1910
ウシ胎児血清	シグマ・アルドリッチ	F7524-500ミリリットル
RPMIミディアム	サーモフィッシャー(GibCo、Life Technologies)	61870044
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー(GibCo、Life Technologies)	15140122
Axiovert 200顕微鏡
フルオ4	サーモフィッシャー(ライフテクノロジーズ)	F14201

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