一次腺房細胞の単離:マウス膵臓から腺房細胞を単離する方法

要約

出典:Fleming Martinez, A. K., et al.3次元細胞培養における膵臓腺房から管への化生の模倣と操作。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、さまざまな消化酵素を含む膵臓腺房細胞(外分泌細胞)を分離するために使用される技術について説明しています。初代腺房細胞は、膵臓がんの発症初期イベントである腺房から乳管への化生(ADM)のex vivo研究に有用です。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とjove獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腺房細胞の単離

1. CO ₂誘導を介してマウスを犠牲にし、頸部脱臼を行います。すぐに膵臓を解剖します。膵臓を解剖するには、まずマウスの足をポリスチレン製の蓋に固定し、尾が研究者に向くようにマウスを向け、腹部に70%エタノールを噴霧します
   手記：代表的な結果で使用されたマウスは、C57BL/6の背景を持つ12週齢の非トランスジェニックメスでした。マウスの選択については、ディスカッションセクションで詳しく説明します。
   1. オートクレーブ処理されたハサミと鉗子のセットを使用して、鉗子を正中線で毛皮/皮膚を持ち上げ、ハサミを使用して尿道口から横隔膜/胸郭領域まで毛皮と皮膚を切開します。
   2. 腹腔がはっきりと見えるように、毛皮/皮膚が切り取られるように、左右に追加の切開を行います。次に、腹膜の内壁に切り込み(中央と右と左に)、毛皮/皮膚で行ったように、臓器から引き離します。
   3. 鉗子で腸を持ち上げ、マウスの左側に置き、淡いピンク色の膵臓が見えるようにスペースを作り、濃い赤の楕円形である脾臓に付着します。膵臓組織は、その柔らかく海綿状の質感が特徴です。胃に沿って走り、腸と絡み合う膵臓を切り取ります。
   4. 脾臓を膵臓から分離します。次に、10 mLのHBSSと1xペニシリン-ストレプトマイシンを含む50 mLのチューブに膵臓を入れ、これを層流フードに持っていき>ます<。 手記：プロトコールの残りのステップは、層流フードで滅菌技術を利用して行う必要があります。
2. 膵臓とHBSS(ペニシリン-ストレプトマイシンを含む)を空の計量ボートに注ぎ、鉗子を使用して膵臓を渦巻かせて洗浄します。次に、鉗子で膵臓をHBSS(ペニシリン-ストレプトマイシンを含む)を含む2番目の計量ボートに移動します。.再度、渦巻き状に膵臓を洗います。
3. 膵臓を3番目のHBSS(ペニシリン-ストレプトマイシン付き)含有計量ボートに移し、膵臓を5mm以下の小片に切断し始めます。次に、膵臓片とHBSSを空の50mLチューブに注ぎます。
   1. これを行うには、計量ボートが傾いているときに、鉗子を使用して膵臓片を液体に移動します。すべてのピースが計量ボートに取り付けられなくなったら注ぎます。鉗子で残りの断片を拾い上げ、HBSSの膵臓を含む50mLチューブで鉗子をペニシリン-ストレプトマイシンで洗浄します。.
4. 931 x gで4°Cで2分間遠心分離し、5 mLピペットでHBSS(および浮いている脂肪)を取り除きます。
5. コラゲナーゼ5mLを加えます(HBSSにHBSS+5%FBS40mL、HBSS+30%FBS20mL、2mg/mLコラゲナーゼ5mLをHBSSで作ります。コラゲナーゼをろ過(0.22μmの細孔)で滅菌し、室温で保存します。各HBSS溶液を氷上に保ちます)膵臓まで。50 mLのチューブをプラスチックパラフィンフィルムで包み、220 rpmで37°C.
   で20分間振とうするインキュベーターに入れて、蓋が密閉されていることを確認します。 手記：コラゲナーゼの消化時間は、議論で述べたように異なる場合があります。インキュベーションの終わりには、大きな組織片が残ることはありません。
6. 解離を止めるには、膵臓を含むチューブを氷の上に置き、5 mLの冷たいHBSS + 5%FBSを加えます。.931 x gで4°Cで2分間遠心分離し、5 mLピペットを使用して上清をピペットで取り除きます。
7. 10 mLのHBSS + 5% FBSに再懸濁し、931 x gで4°Cで2分間遠心分離します。5 mLのピペットを使用して上清をピペットで取り除き、さらに10 mLのHBSS + 5% FBSでこのステップを繰り返します。
8. 5 mLのHBSS + 5% FBSに再懸濁し、P1000を使用して、一度に1 mLを500 μmメッシュで50 mLチューブに移します。P1000でメッシュを通してさらに5mLのHBSS + 5%FBSを追加し、メッシュを通して残りの膵臓細胞を洗浄します。
9. P1000を使用して一度に1 mLをピペッティングすることにより、500 μmメッシュの細胞懸濁液を105 μmメッシュに通します。次に、細胞懸濁液をHBSS + 30%FBSを含むチューブに静かにピペッティングします。上部に細胞懸濁液の層が形成されます。遠心分離すると、腺房細胞は沈んでペレットを形成します。
10. 233 x gで2分間、4°Cで遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを1x Waymouthの完全培地に再懸濁します。
    1. コラーゲンまたは基底膜マトリックスへの細胞の包埋に直接進む場合は、膵臓あたり7 mLの容量で再懸濁します。アデノウイルスまたはレンチウイルス感染に進行した場合は、 ?? 臓あたり4 mLに再懸 ?? します。.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
37°C振とうインキュベーター	サーモサイエンティフィック	SHKE4000-7
5% CO2、37 °C インキュベーター	ヌアイレ	NU-5500
50mlチューブ	隼	352070
吸収性パッド、20インチ x 24インチ	フィッシャーブランド	1420662
BDプレシジョングライドニードル 21G×1/2	フィッシャーサイエンティフィック	305167	解剖用のピンとして使用
ビーカー、600 mL	フィッシャーブランド	FB-101-600
遠心機	ベックマン・コールター	アレグラX-15R遠心分離機
コラゲナーゼI型、Clostridium histolyticum	シグマ	C0130-1G	粉末を滅菌分子生物学グレードの水に溶解して、100 mg/mLの溶液を作成します。1つのアリコートを解凍するときは、10 mg / mlに希釈し、ろ過滅菌して1 mlのアリコートを-20°Cに置きます。
デキサメタゾン	シグマ	D1756	粉末をメタノールに溶解し、分注して-20°Cで保存することにより、4 mg / ml溶液を作成します。
エタノール、200プルーフ	デコン研究所	2701
ウシ胎児血清	シグマ	F0926-100mL
鉗子	ファインサイエンスツール	11002から12
鉗子	ファインサイエンスツール	91127から12
ハンクスバランスソルトソリューション(HBSS)、カルシウム不使用、マグネシウム不使用、フェノールレッド不	フィッシャーサイエンティフィック	SH3048801
アイスペール、長方形	フィッシャーサイエンティフィック	07-210-103
LAB GUARD 検体用バッグ(解剖後マウス用)	ミニグリップ	SBL2X69S
パラフィルム	ビーミス	PM992	原稿では「プラスチックパラフィンフィルム」と呼ばれ
PBSの	フィッシャーサイエンティフィック	02 SH30028月
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
ピペットチップ、10 μl	USAサイエンティフィック	〒1110-3700
ピペットチップ、1000 μl	オリンパスのプラスチック	24から165RL
ピペットチップ、200 μl	USAサイエンティフィック	1111-1700
ピペットエイド	ドラモンド
ピペットマンクラシックP10、1-10μl	ギルソン	F144802
ピペットマンクラシックP1000、200-1000μl	ギルソン	F123602
ピペットマンクラシックP20、2-20μl	ギルソン	F123600
ピペットマンクラシックP200、20-200μl	ギルソン	F123601
ピペット、10 ml	隼	357551
ピペット、25 ml	隼	357525
ピペット、5 ml	隼	357543
ポリプロピレンメッシュ、105 μm	スペクトラムラボ	146436
ポリプロピレンメッシュ、500 μm	スペクトラムラボ	146418
鋏	ファインサイエンスツール	14568から12
鋏	ファインサイエンスツール	14568から13
重炭酸ナトリウム(微細な白色粉末)	フィッシャーサイエンティフィック	BP328-500
水酸化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S318-500
大豆トリプシン阻害剤	ギブコ	17075029
スパーテル	フィッシャーブランド	21-401-10
Steriflip 50 ml、0.22ミクロンフィルター	ミリポア	SCGP00525
I型ラットテールコラーゲン	コーニング	354236
ウェイマウス MB 752/1 ミディアム (パウダー)	シグマ	W1625-10X1L
計量ボート、六角形、中	フィッシャーブランド	02-202-101

さん 名 使用 の ています