腺房から乳管への化生誘導:3D ex vivo培養における腺房細胞から管細胞への分化を研究する方法

要約

出典:Fleming Martinez, A. K. et. al. 3次元細胞培養における膵臓腺房から管への化生の模倣と操作。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、ex vivo 3D培養で膵臓腺房細胞を管細胞に分化する技術について説明しています。これは、膵臓がんの初期発症における重要なプロセスである腺房から乳管への化生(ADM)を調節するメカニズムを理解するのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 材料、溶液、3次元マトリックスベースの準備

1. 500 μmと105 μmのポリプロピレンメッシュを76 mm x 76 mmの正方形にカットします。各正方形を半分に2回折り、小さな折り畳み正方形を作成します。500 μmメッシュ1枚と105 μmメッシュメッシュ1枚をオートクレーブ可能なポーチに入れます。
2. オートクレーブポリプロピレンメッシュスクエア、および2組のはさみと鉗子。
3. 100 mLの10x Waymouthの溶液を作ります。1バイアル(14 g)のWaymouthの粉末を50 mLの脱イオン(DI)水にかき混ぜ、溶解したら30 mLの7.5%(75 g / L)重炭酸ナトリウムを加えます。.DI水を使用して最終容量を100mLにし、ろ過滅菌します。
   1. 10x Waymouthの培地を4°Cで保存し、コラーゲンジェルと1x Waymouthの培地の調製にご使用ください。沈殿物が形になったら、捨てます。
4. 125 μLの40 mg/mL大豆トリプシン阻害剤、12.5 μLの4 mg/mLデキサメタゾン、および500 μLのウシ胎児血清(FBS)を添加して、膵臓あたり50 mLの1x Waymouthの完全培地を作製します。ろ過により滅菌し、48時間以内に使用してください。
5. コラーゲンまたは基底膜マトリックスを使用して、3次元マトリックスベースを調製します(製品情報については、材料の表を参照)。ベースをピペッティングするときは、プレートを氷の上に置き、気泡を避け、各ウェルの容量をピペッティングした直後にプレートを回転させて、完全にカバーされるようにします。
   1. 組織培養フード内の氷上で次の成分を混合することにより、コラーゲン塩基を作成します:5.5 mLのI型ラットテールコラーゲン、550 μLの10x Waymouth's Media、および366.6 μLの0.34 M NaOH(ろ過済み)
      注:これは、24ウェル、12ウェル、または6ウェルプレート1枚のコラーゲンベースを作成するのに十分な溶液です。1つの膵臓からの腺房の分離には、1つのプレートで十分です。
   2. コラーゲンベースをプレートするには、80 μL(8ウェルスライドガラス)、200 μL(24ウェルプレート)、400 μL(12ウェルプレート)、または800 μL(6ウェルプレート)を使用します。
   3. 基底膜マトリックスベースの場合、追加のコンポーネントなしでマトリックスをピペットで置き換えます。各ウェルの容量は、50 μL(8ウェルスライドガラス)、120 μL(24ウェルプレート)、240 μL(12ウェルプレート)、または600 μL(6ウェルプレート)です。
   4. 細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO₂)で塩基を少なくとも30分間固化させてから、これらの塩基の上に細胞を埋め込んだマトリックスの第2層を作成します。
6. 腺房分離の準備として、600 mLビーカー1つ、50 mLチューブ3本、オートクレーブ入りのハサミ1本、オートクレーブ入りの鉗子1組、アイスバケツ1個をボンネットの下に保管し、3つの計量ボートを取り付けます。次に、300 μL の 100x ペニシリン - ストレプトマイシンで 30 mL の HBSS を調製し、10 mL を 2 つの計量ボートのそれぞれに入れ、最後の 10 mL を 50 mL チューブに保持します (ステップ 1.8.2 および 2.1.4 で使用)。
7. HBSSにHBSS + 5% FBSを40 mL、HBSS + 30% FBSを20 mL、2 mg/mLコラゲナーゼを5 mL調製します。コラゲナーゼをろ過(0.22μmの細孔)で滅菌し、室温で保存します。各HBSS溶液を氷上に保ちます。
8. 膵臓解剖用のワークスペースを組み立て、これはラボベンチで行うことができます。
   1. テーブルに吸収パッドを置き、ホイルで覆われたポリスチレンの蓋をします。次に、ホイルの上に4本のピンが付いたペーパータオルを置きます。
   2. 焼却作業場には、焼却バッグ、オートクレーブ滅菌されたハサミと鉗子1セット、70%エタノール入りスプレーボトル、アイスバケツ(ステップ1.6のペニシリン-ストレプトマイシンを含むHBSSの50mLチューブ付き)を手の届くところに置いてください。
9. 遠心分離機を4°Cに、シェーカーを37°Cに設定します。

2. 上房細胞の単離

1. CO₂誘導を介してマウスを犠牲にし、頸部脱臼を行います。すぐに膵臓を解剖します。膵臓を解剖するには、まずマウスの足をポリスチレン製の蓋に固定し、尾が研究者に向くようにマウスを向け、腹部に70%エタノールをスプレーします
   注:代表的な結果で使用されたマウスは、C57BL/6の背景を持つ12週齢の非トランスジェニック雌でした。マウスの選択については、ディスカッションセクションで詳しく説明します。
   1. オートクレーブ処理されたハサミと鉗子のセットを使用して、鉗子を正中線で毛皮/皮膚を持ち上げ、ハサミを使用して尿道口から横隔膜/胸郭領域まで毛皮と皮膚を切開します。
   2. 腹腔がはっきりと見えるように、毛皮/皮膚が切り取られるように、左右に追加の切開を行います。次に、腹膜の内壁に切り込み(中央と右と左に)、毛皮/皮膚で行ったように、臓器から引き離します。
   3. 鉗子で腸を持ち上げ、マウスの左側に置き、淡いピンク色の膵臓が見えるようにスペースを作り、濃い赤の楕円形である脾臓に付着します。膵臓組織は、その柔らかく海綿状の質感が特徴です。胃に沿って走り、腸と絡み合う膵臓を切り取ります。
   4. 脾臓を膵臓から分離します。次に、10 mLのHBSSと1xペニシリン-ストレプトマイシンを含む50 mLのチューブに膵臓を入れ、これを層流フードに持っていき>ます<。 手記： プロトコールの残りのステップは、層流フードで滅菌技術を利用して行う必要があります。
2. 膵臓とHBSS(ペニシリン-ストレプトマイシンを含む)を空の計量ボートに注ぎ、鉗子を使用して膵臓を渦巻かせて洗浄します。次に、鉗子で膵臓をHBSS(ペニシリン-ストレプトマイシンを含む)を含む2番目の計量ボートに移動します。.再度、渦巻き状に膵臓を洗います。
3. 膵臓を3番目のHBSS(ペニシリン-ストレプトマイシン付き)含有計量ボートに移し、膵臓を5mm以下の小片に切断し始めます。次に、膵臓片とHBSSを空の50mLチューブに注ぎます。
   1. これを行うには、計量ボートが傾いているときに、鉗子を使用して膵臓片を液体に移動します。すべてのピースが計量ボートに取り付けられなくなったら注ぎます。鉗子で残りの断片を拾い上げ、HBSSの膵臓を含む50mLチューブで鉗子をペニシリン-ストレプトマイシンで洗浄します。.
4. 931 x gで4°Cで2分間遠心分離し、5 mLピペットでHBSS(および浮いている脂肪)を取り除きます。
5. 5 mLのコラゲナーゼ(ステップ1.7でHBSSで希釈)を膵臓に加えます。50 mLのチューブをプラスチックパラフィンフィルムで包み、220 rpmで37°C.
   で20分間振とうするインキュベーターに入れて、蓋が密閉されていることを確認します。 注:コラゲナーゼの消化時間は、ディスカッションで述べたように異なる場合があります。インキュベーションの終わりには、大きな組織片が残ることはありません。
6. 解離を止めるには、膵臓を含むチューブを氷の上に置き、5 mLの冷たいHBSS + 5%FBSを加えます。.931 x gで4°Cで2分間遠心分離し、5 mLピペットを使用して上清をピペットで取り除きます。
7. 10 mLのHBSS + 5% FBSに再懸濁し、931 x gで4°Cで2分間遠心分離します。5 mLのピペットを使用して上清をピペットで取り除き、さらに10 mLのHBSS + 5% FBSでこのステップを繰り返します。
8. 5 mLのHBSS + 5% FBSに再懸濁し、P1000を使用して、一度に1 mLを500 μmメッシュで50 mLチューブに移します。P1000でメッシュを通してさらに5mLのHBSS + 5%FBSを追加し、メッシュを通して残りの膵臓細胞を洗浄します。
9. P1000を使用して一度に1 mLをピペッティングすることにより、500 μmメッシュの細胞懸濁液を105 μmメッシュに通します。次に、細胞懸濁液をHBSS + 30%FBSを含むチューブに静かにピペッティングします。上部に細胞懸濁液の層が形成されます。遠心分離すると、腺房細胞は沈んでペレットを形成します。
10. 233 x gで2分間、4°Cで遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを1x Waymouthの完全培地に再懸濁します。
    1. コラーゲンまたは基底膜マトリックスへの細胞の包埋に直接進む場合は、膵臓あたり7 mLの容量で再懸濁します。アデノウイルスまたはレンチウイルス感染に進行した場合は、 ?? 臓あたり4 mLに再懸 ?? します。.

3. ウイルス感染

1. 1つの膵臓が2つのウイルス感染(対照および実験的、例えば、nullおよびcre)に十分であるため、細胞懸濁液を2つの35mmプレートの蓋の間で分割します。プレートの蓋を使用することで、懸濁液での感染が可能になり、後で最終基板への移動が容易になります。
   1. ウイルスを扱うときは、使用済みのすべてのピペットチップを10%漂白剤に少なくとも15分間浸してください
      手記： 35 mmプレートと4 mLの容量の利用は、生後8〜16週齢の非トランスジェニックマウスの細胞に適しています。プレートのサイズと体積は、膵臓が小さい動物または大きい動物に合わせて調整する必要がある場合があります。
2. アデノウイルス感染の場合は、ウイルス(力価10⁷ TU/mL以上)を1:1,000希釈で各プレートの蓋に添加し、渦巻きます(図1、GFPアデノウイルス)。プレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO₂)に入れ、15分ごとに1時間渦巻く。さらに2時間インキュベーションを続けた後、コラーゲンまたは基底膜マトリックスへの細胞の埋め込みに進みます。
3. フード内でのウイルス作業が完了したら、フード内のすべてのコンポーネントを10%漂白剤に少なくとも15分間浸し、次に70%エタノールを使用して漂白剤を完全に洗浄します。

4. コラーゲンまたは基底膜マトリックスへの細胞の埋め込み

1. 7 mLのI型ラットテールコラーゲン(3.3 mg/mL)、700 μLの10x Waymouth培地、466.6 μLの0.34 M NaOHを組み合わせて、氷上でコラーゲンゲルを作製します。
2. 等量のコラーゲンゲルと細胞懸濁液を取り、穏やかに混合します。刺激または阻害剤を追加する場合は、これをコラーゲン細胞懸濁液と組み合わせます。一度に1ウェルずつプレートします(ステップ1.5.3のプレート)。プレートを氷の上に置いたまま、コラーゲン細胞層を均一に分布させるために渦巻きます。
   1. 各ウェルで、200 μL(8ウェルスライドガラス)、500 μL(24ウェルプレート)、1000 μL(12ウェルプレート)、または2000 μL(6ウェルプレート)のコラーゲン細胞懸濁液をピペットで交換します。ADMは、図1のTGF-α(50 ng/mL)による刺激によって誘導されることに注意してください。
3. 基底膜マトリックスに細胞を埋め込むには、1液性基底膜マトリックスと2液性細胞懸濁液を混合します。コラーゲンと同様に、マトリックス細胞懸濁液とプレートを氷上に保ちます。4.2.1に記載されているのと同じ量を使用して一度に1ウェルずつピペッティングし、均等に分配するために渦巻き巻きます。
4. プレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO₂)に30分間置いて固化させた後、任意の刺激または阻害剤を含む1x Waymouthの全培地を添加します(図1はTGF-αを50 ng/mLで使用しています)。メディア(刺激または阻害剤を含む)を翌日に交換し、その後は1日おきに交換します。刺激に応じて、ADMは3日目から5日目の間に観察できます。

結果

図1:TGF-αによる刺激後にコラーゲン内にプレーティングされた初代腺房細胞の代表的な結果。非トランスジェニックマウスの初代腺房細胞をGFPアデノウイルスに感染させ、コラーゲンIまたは基底膜マトリックスに包埋し、TGF-α(50 ng/mL)の有無にかかわらず刺激しました。GFPアデノウイルスの感染後24時間後に、感染効率を示すために画像を撮影しました。感染後5日で、画像はコラーゲンまたは基底膜マトリックス中のTGF-αの有無にかかわらず刺激された細胞の違いを示しています。ダクト状の構造物は白い矢印で示され、スケールバーは50μmを表します。画像は、EC Plan-Neofluar 1...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5% CO2、37 °C インキュベーター	ヌアイレ	NU-5500
50mlチューブ	隼	352070
ビーカー、600 mL	フィッシャーブランド	FB-101-600
アデノウイルス、Ad-GFP	ベクターバイオラボ	1060
デキサメタゾン	シグマ	D1756	粉末をメタノールに溶解し、分注して-20°Cで保存することにより、4 mg / ml溶液を作成します
ウシ胎児血清	シグマ	F0926-100mL
鉗子	ファインサイエンスツール	11002から12
スライドガラス、8ウェル	ラボテック	177402
アイスペール、長方形	フィッシャーサイエンティフィック	07-210-103
マトリゲル	コーニング	356234	原稿では「基底膜マトリックス」と呼ばれています。
PBSの	フィッシャーサイエンティフィック	02 SH30028月
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
プレート、12ウェル	コーニング共演	3513
プレート、24ウェルプレート	コーニング共演	3524
プレート、6ウェル	隼	353046
ポリプロピレンメッシュ、105 μm	スペクトラムラボ	146436
ポリプロピレンメッシュ、500 μm	スペクトラムラボ	146418
鋏	ファインサイエンスツール	14568から12
重炭酸ナトリウム(微細な白色粉末)	フィッシャーサイエンティフィック	BP328-500
水酸化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S318-500
大豆トリプシン阻害剤	ギブコ	17075029
I型ラットテールコラーゲン	コーニング	354236
ピペットマンクラシックP10、1-10μl	ギルソン	F144802
ピペット、5 ml	隼	357543
ピペットチップ、10 μl	USAサイエンティフィック	〒1110-3700
ピペットチップ、1000 μl	オリンパスのプラスチック	24から165RL
ピペットチップ、200 μl	USAサイエンティフィック	1111-1700
ピペット、25 ml	隼	357525
ピペットエイド	ドラモンド
ピペット、10 ml	隼	357551
ピペットマンクラシックP200、20-200μl	ギルソン	F123601
ピペットマンクラシックP1000、200-1000μl	ギルソン	F123602
ピペットマンクラシックP20、2-20μl	ギルソン	F123600
ウェイマウス MB 752/1 ミディアム (パウダー)	シグマ	W1625-10X1L
計量ボート、六角形、中	フィッシャーブランド	02-202-101

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