コラゲナーゼ灌流による膵島単離:膵島細胞を単離するための酵素的方法

要約

出典:Villarreal D. et al. マウスからの膵島単離のためのシンプルな高効率プロトコル。J. Vis. Exp. (2019年)

膵島は、ランゲルハンス島とも呼ばれ、グルコース調節やその他の重要な生物学的機能のためのホルモンを産生する内分泌細胞のクラスターです。このプロトコルでは、最初にAmpulla of Voterを介してコラゲナーゼを灌流して外分泌膵臓組織を消化し、マウスから膵島を精製するための簡略化された密度勾配遠心分離を行うことで、膵島を分離する方法を説明しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

必要な手術器具を図1に、手術の概略図を図2に示します。

1. ソリューション

1. 100 mLの10X HBSS(ストックから)を900 mLの蒸留水に加えて1 L HBSS(1X)を作ることにより、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)を調製します。
2. 50 mLの100X ウシ胎児血清(FBS)を450 mLの氷冷1X HBSSに加えて、STOP溶液(新鮮にし、1時間以内に使用する必要があります)を調製します。これにより、500 mLのSTOP溶液が得られます。STOP溶液を4°Cに保ちます。
3. コラゲナーゼP溶液(使用後1時間以内に新鮮にする必要があります)を調製し、コラゲナーゼPを氷冷した1X HBSSに1 mg/mL加えます。マウスあたり6 mLを使用します。
   1. 0.05%(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)をコラゲナーゼP溶液に添加します(これにより、単離された島に栄養素が供給されます)。例えば、3 mgのBSAを6 mLのコラゲナーゼP溶液に溶かし、氷上に置いてください。
   2. 1本の50 mLチューブにすべてのマウスに必要なコラゲナーゼPの量を計算して調製します。
4. 10% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、INS-1 細胞サプリメント (10 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、0.05 mM 2-メルカプトエタノール) を 5.5 mM グルコースを含む 500 mL RPMI 1640 培地に添加して、一晩の培養およびインキュベーションに使用する完全な RPMI 1640 培地を調製します。

2. 準備

1. 25 mL RNase阻害溶液、70%エタノール、または蒸留H₂Oの50 mLチューブ3本を満たします。これらのソリューションは、手術前および手術中の手術器具の洗浄に使用されます。
2. プロトコールを開始する前に、ツールの先端をRNase阻害溶液に30分間浸します。これにより、ツール上の潜在的なRNaseが排除されます。
3. 吸収性パッドを6インチ×6インチのサイズにあらかじめカットし、手術中に使用できます。
4. 1X HBSS溶液を事前に調製し、4°Cで保存してください。4°Cで保存してください。
5. 手術の直前にコラゲナーゼP溶液を調製し、氷上に保存します.
   手記：これは準備から2時間以内に使用する必要があります。.
6. 消化および精製用に50 mLチューブを標識し、マウスごとに2本ずつ調製し、1本は消化用、もう1本は膵島精製用とします。動物IDが両方のチューブにあることを確認します。
7. 最初の50 mLチューブに3 mLのコラゲナーゼP溶液を加えます。残りの 3 mL のコラゲナーゼ P を注入します。
8. 残りの3 mLのコラゲナーゼ溶液を、30 G 1/2 in needleを装着した3 mLシリンジに引き込みます。シリンジを氷の上に置きます。

3. 手順

1. RNase阻害溶液からすべてのツールを取り出し、最初に70%エタノールを入れたチューブに浸し、次に蒸留H₂Oを含むチューブに浸し、清潔なペーパータオルで風乾します。
2. マウスを0.5 mLのイソフルランが入ったチャンバーにマウスを深く麻酔するまで置きます。.
3. マウスをチャンバーから取り外し、鉗子でフットパッドをつまんで麻酔の状態を確認します。深部麻酔は、呼吸が着実に遅くなり、マウスが足をつまむことに反応しないという観察に基づいています。マウスが深く麻酔されていることを確認した後、子宮頸部脱臼でマウスを安楽死させ、マウスを吸収パッドに置きます。
   1. 麻酔をかけたマウスをうつ伏せに置き、首に圧力をかけ、尻尾を引いて脳から脊柱を脱臼させます。
4. マウスの四肢を仰臥位にして吸収パッドにテープで固定し、体に70%エタノールをスプレーし、余分なエタノールを拭き取ります。
5. カバーガラス鉗子と湾曲した手術用ハサミを使用して切開します。まず、腹部の皮膚(~3cm)に水平切開を行い、皮膚を大きく開いて腹壁を露出させます。次に、腹部腹膜に垂直切開(~3〜4cm)を行い、腹腔内の膵臓を完全に露出させます(図3)。
6. 肝臓の葉を上向きに押して胆管を露出させると、淡いピンク色の管として現れます(図3)。
7. 腹腔の右腰椎/腸骨領域から腸管を右に慎重に動かし、胆管と肝動脈を露出させます(図3)。
8. Schwartz micro serrefines(図1)を使用して、総胆管を肝臓にできるだけ近づけて慎重にクランプします。
9. 膵管と総胆管の結合によって形成される十二指腸乳頭に位置するVaterの膨大部を特定します。Vaterの膨大部は、総胆管への入口である解剖顕微鏡で見ると腫れて見えます(図4).
   手記：解剖顕微鏡の光の強度/角度を調整すると、探しやすくなります。
10. コラゲナーゼP溶液3 mLを入れたシリンジをVaterの膨大部に挿入します。図5に示すように、針を総胆管の長さの約1/4(膨大部は管に通じています)だけ管に押し込みます。
11. 針が膨大部に入ったら、針の向きがダクトと平行になるようになっていることを確認します。
12. マイクロアドソン鉗子でクランプして針を安定させ、ダクトに穴を開けないようにします(図5)。
13. 図6に示すように、シリンジから3 mLのコラゲナーゼP溶液を総胆管にゆっくりと着実に注入します(抵抗を感じる程度)。目標は、コラゲナーゼを膵管に強制的に入らせるための逆流圧力を作り出すことです。膵臓の頭、首、体、尾の領域がすべて完全に膨らんでいる場合、注射は成功したと見なされます.
    手記：膵臓が完全に膨らんでいないか、脾臓領域が完全に膨らんでいない場合、膵島の歩留まりは低くなります。脾臓領域には、最も多くの小島^{が含まれています 6}。インフレーションは、溶液で満たされた膵臓組織間のオープンスペースの出現によって確認できます。
14. 膨らませた膵臓を慎重に解剖し、3mLの氷冷コラゲナーゼP溶液を含む50mLの消化チューブに入れます。
    1. 2つの鉗子(湾曲した鉗子とマイクロアドソン;図1を参照):(脾臓から始めて、膵臓を脾臓から引き離し、胃から十二指腸に沿って除去を続けます.
       手記：切開は必要ありません。
    2. 細い手術用ハサミを使用して、消化チューブ内で3 mLの氷冷コラゲナーゼP溶液で膵臓を3〜5秒間刻みます(図7A)。
15. チューブを37°Cのウォーターバスでラックに固定し、100〜120rpmで約12〜13分間振とうします。
16. インキュベーション後、コラゲナーゼP消化溶液が均一になるまで、チューブを手で静かに振って組織を破壊します(図7B)。均質性は、膵臓の微粒子の砂のような外観によって確認されます。通常、約30秒の穏やかな握手で十分です。チューブを光にかざして、組織が十分に均質化されているかどうかを調べます。必要に応じて、さらに~15秒間振とうします。
17. 消化したら、すぐにチューブを氷の上に置き、40 mLの氷冷STOP溶液を加えて酵素消化を終了します><。 手記：この時点で、消化チューブは、複数のマウスで作業する場合、最大2時間氷上に放置できます。
18. スイングバケット遠心分離機でチューブを300 x gで30秒間遠心分離します(遠心分離機の温度は柔軟です).
    手記：スウィングバケット遠心分離機を使用して、組織ペレットがチューブの壁ではなく50mLチューブの底に形成されるようにします。これは、膵島の収量を向上させるために重要です。
19. デカンテーションを行い、STOP溶液で遠心分離をさらに2回繰り返し、各スピン後に溶液をデカントします。その後の洗浄ごとに20mLのSTOP溶液を使用してください。.
    1. 各スピンの前に、20 mL STOP溶液中の50 mLチューブ内の組織ペレットを静かに振とうして、ペレットを乱します。
20. 組織ペレットを氷冷HBSS40 mLで再懸濁し、300 x gで30秒間遠心分離します。
21. HBSS溶液を入れたスイングバケット遠心分離機を使用して遠心分離をさらに2回デカントして繰り返し、各スピン後に溶液をデカントします。洗濯ごとに20mLのHBSSを使用してください。
    1. 各スピンの前に、ペレットを中断し、20mLのHBSS溶液を含むチューブを静かに振ってチューブの底からペレットを分離します。
22. 最後の遠心分離後、すべてのHBSSを取り外してください。
23. 次に、ペレットを含む50 mLのチューブに5 mLの室温密度グラジエントを加えます。均質化されるまで低速で短時間ボルテックスします。
24. 室温密度勾配をさらに5 mL 50 mLチューブに加えます。ボルテックス/混合しないでください。
    手記：中断することなくより良い勾配を形成できるように、安定して静止していることが重要です。
25. 室温のHBSS緩衝液10mLをチューブ(密度勾配を含む)にピペットで注入し、ゆっくりとゆっくりと滴下してグラジエントを形成します。10 mLピペット付きのピペットガンを使用して、HBSSを滴下します。
26. スイングバケット遠心分離機を使用して、1700 x gでチューブを15分間回転させ、加速/減速の両方の速度を最低設定に変更して、勾配を維持してください(図7C)。
27. スピン後、勾配を乱さないようにチューブを慎重に取り外します。冷たくなったHBSSであらかじめ湿らせたピペットガン(ピペットHBSSを上下に)を使用して、密度勾配とHBSSの間に形成された膵島の層(5〜10 mL)を新しい50 mLの膵島収集チューブにピペットで取り出します><。 手記：膵島をピペッティングする前に、ピペットを冷たいHBSSで濡らして、膵島がピペットの内壁にくっつくのを防ぐと便利です。
    1. 分離が不完全な場合、膵島は密度勾配層に見えるでしょう、密度勾配(最下層)の10 mL全体と界面で形成された膵島層をピペットで取り出します(HBSS最上層の約8〜10 mLを残すだけです)
       手記：膵島レイヤーと密度勾配レイヤー (最下層) の両方を収集すると、破片が収集され、膵島のピッキング時間が長くなる可能性がありますが、他の手順は変更されません。これらの層を両方とも収集することは、膵島層が整形成されている場合には必要ありません。
28. 氷冷したHBSS20 mLを、膵島が入った新しい50 mLチューブに加え、スイングバケット遠心分離機で350 x gで3分間遠心分離します。
29. スピン後、上清を慎重にピペットで排出します(底部に~3mLを残します)底部の膵島を含むペレットを乱さないようにします。上清を捨てます。
30. 洗浄と遠心分離を少なくとも3回繰り返します。毎回20mLのHBSSを加え、各スピンの前にペレットを懸濁させてください。
31. RPMI-1640コンプリートメディアボトルは、使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください。最後の遠心分離後、すべてのHBSSを取り出し、以前に調製した完全なRPMI-1640培地(FBS、INS-1細胞サプリメント、ペニシリン/ストレプトマイシンを含む)を4 mLペレットに加えます。
32. チューブを静かに渦巻いてペレットを取り出し、すぐにRPMI-1640メディアを100mmのペトリ皿に注ぎます。さらに5mLのRPMI-1640培地をチューブに加え、静かに渦巻いて残っている膵島を洗い流し、同じシャーレに培地を注ぎます。
    1. 解剖顕微鏡下で、20 μLピペットを使用してペトリ皿から健康な膵島を取り出し、10 mLの完全なRPMI 1640培地を含む新しいペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡で見ると、膵島は球形/長方形で、比較的透明でかすかな外分泌組織と比較して、表面が滑らかな黄金色に見えるはずです
       手記：解剖顕微鏡の倍率は通常12.5〜16倍に設定されています。膵島の収量は、マウスの系統、年齢、性別など、さまざまな要因によって異なります。このプロトコルは、通常、生後4〜10ヶ月齢の健康なC57BL/6Jマウスから250〜350の健康な膵島をもたらします。
翌日の
33. 実験のために、5%の_CO2注入と95%の加湿空気を用いて、37°Cの滅菌インキュベーターで膵島をインキュベートするか、後で目的の分析のために膵島を凍結します。
    1. 凍結された膵島は、分泌アッセイに使用できず、RNAまたはタンパク質の定量にのみ使用できます。凍結する細胞を採取するには、HBSSバッファーに入れ、すべての膵島を200〜500 μLのバッファーに回収し、1.5 mLチューブに移し、350 x gを1〜2分間遠心分離し、上清を除去して30〜40 μL以下の溶液を残し、短期保存(数日)の場合は-20°C、長期保存の場合は-80°Cに入れます。

結果

図1:手術器具。
湾曲手術用ハサミ、カバーガラス鉗子、マイクロアドソン鉗子、湾曲鉗子、小型手術用ハサミ、シュワルツマイクロセリファイス(微小血管クランプ)が示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:プロトコ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3 mLシリンジ	BDの	309657	コラゲナーゼP
カバーガラス鉗子	VWRの	82027-396	切開処置を助けるためにマウスの皮膚を保持する
湾曲した鉗子	シグマ・アルドリッチ	Z168696	膵臓摘出中の組織保持
100mmシャーレ	VWRの	30-2041	膵島文化に利用
30 G.1/2インチ針	BDの	305106	コラゲナーゼPを送達するためのvaterのAmpullaの浸透のために - このゲージは、ほとんどのCBDによく適合するように使用されています
50mlチューブ	VWRの	89039-658	消化された膵臓組織、コラゲナーゼP、精製された膵島を保持
防水 の吸収パッド 防湿バリア	VWRの	82020-845	外科的処置から血液を吸収するため
遠心分離機5810R、スイング付き バケットと減速能力	エッペンドルフ	5811FJ478114	ティッシュのペレット化に使用すると、ペレットは円錐形のチューブの底に形成されます-スイングバケット遠心分離機が必要です。また、宣言機能は、グラデーションレイヤーを形成するために重要です
コラゲナーゼP- 1g	ロシュ・ダイアグノスティック	11249002001	外分泌膵臓の消化に
湾曲した手術用ハサミ	フィッシャーサイエンティフィック	13-804-21	マウスの腹部を切断するため
解剖顕微鏡	オリンポス	SZX16	主要な解剖学的構造の特定に使用され、精度 コラゲナーゼを膵臓に導入する
ハンクのバランスの取れた塩溶液10倍	コーニング	20-023-履歴書	細胞の洗浄
Histopaque-1077	シグマ	RNBF5100	グラジエント形成用
光源	リーズ	LR92240	顕微鏡の視認性向上
RPMI-1640 L-グルタミン無し媒体	コーニング	15-040-履歴書	膠島の培養
Schwartz micro serrefines (微小血管クランプ)	ファインサイエンスツール	18052-01	総胆管と のクランプ 肝動脈
揺れるウォーターバス	ベーケル/グラント	8R0534008	外分泌組織の機械的消化に重要
小さな手術用ハサミ	VWRの	82027-578	膵臓に付着した組織を切断
RNaseZap	フィッシャーサイエンティフィック	AM9780	RNaseの除去用
イソフルラン	ピラマル	B13B16A	手術前にマウスに麻酔をかける

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