スフェロイドの免疫蛍光染色:細胞内および細胞外抗原発現の発現に関するスフェロイドの分析技術

要約

出典:Cavaco, A. C. M. et al.がん関連線維芽細胞の分化および浸潤in vitro研究のためのより生理学的なシステムとしての3Dスフェロイドモデル。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、線維芽細胞またはCAFの分化を理解するためのスフェロイドの免疫蛍光染色の技術について説明しています。このプロトコールは、スフェロイド内のECMタンパク質の沈着を含む、細胞内および細胞外抗原の発現を検出するのに役立ちます。

プロトコル

1. スフェロイドの免疫蛍光染色

1. 約24時間後に、実験条件または分析するタンパク質ごとに1つの1.5 mL反応チューブにスフェロイドを回収します。例えば、TGF-β1で刺激したiNFのスフェロイドを、未処理のコントロールiNFとは異なるチューブに入れます。強すぎるせん断力によるスフェロイドの破裂を避けるために、ピペットの先端をカットしてオリフィスを拡大します。1つの反応チューブに少なくとも5〜10個のスフェロイドを含めて、反復を可能にし、洗浄ステップ中に起こりうる損失を考慮に入れます。
2. ベンチトップ遠心分離機でスフェロイドを1,000 x gで約30〜60秒間遠心分離します。ペレット化されたスフェロイドを乱さずに、ピペッティングによりメチルセルロース含有上清を慎重に除去します。
3. 50 μLの1x PBSで洗浄します。遠心分離ステップを繰り返し、1.2で説明されているようにピペッティングしてPBSを慎重に除去します。
4. 染色するタンパク質に応じて、PBS中の4%パラホルムアルデヒド50 μLで室温で20分間固定するか(αSMA、NG2、インテグリンα3β1の場合)、またはメタノール50 μLで-20°Cで10分間固定します(ラミニン-332サブユニットの場合)。
5. 手順1.2〜1.3で説明したように、洗浄手順を繰り返します。
6. 0.1% Triton-XをPBS中で室温で4分間細胞に透過処理します。
7. 手順1.2〜1.3で説明した洗浄手順を3回繰り返します。
8. スフェロイドを5%FBSと2%BSAを含むPBSでRTで1時間インキュベートし、非特異的なタンパク質相互作用部位をブロックします。
9. スフェロイドをPBS、2.5% FBS、1% BSA中の30 μLの一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。以下の一次抗体を使用しました:抗αSMA Cy-3標識および抗NG2(5 μg/mL);BM2 抗ラミニン α3、6F12 抗ラミニン β3、抗ラミニン γ2 20 μg/mL。
10. 手順1.2〜1.3で説明した洗浄手順を3回繰り返します。
11. スフェロイドをPBS、2.5% FBS、および1% BSA中の30 μLの二次抗体と室温で90分間インキュベートします。使用した二次抗体は、Alexa 488抗ウサギおよび抗マウス(5 μg/mL)でした。
12. 手順1.2〜1.3で説明した洗浄手順を3回繰り返します。
13. 細胞を30 μLのDAPI染色溶液と室温で4分間インキュベー
トします。
14. 手順1.2〜1.3で説明したように、洗浄手順を繰り返します。
15. ガラスパスツールピペットを使用して、スライドガラスのPBSにスフェロイドを置きます。
16. レーザー走査型顕微鏡の蛍光顕微鏡でスフェロイドを10倍の倍率でイメージングします。zスタックの異なる光学面(15-20スタック面)で回転楕円体の異なる光学断面を取ります。顕微鏡でレーザー設定を確立するには、目的の抗原に対して陰性の細胞で構成されたスフェロイド、または二次抗体のみで染色されたスフェロイドを使用します。比較するすべてのサンプルに同じ設定を再利用します。
17. 以前に公開されたImageJソフトウェアを使用して顕微鏡画像を分析します。手順を図 1 にまとめます。バックグラウンドとして、無細胞関心領域(ROI)の積分シグナル密度を決定します。総補正細胞蛍光(TCCF)を次のように計算します:
    TCCF = 積分シグナル密度 - (選択したスフェロイドの面積 x 背景の平均蛍光)
18. TCCFをスフェロイドの面積とスタック数に正規化したスフェロイドの総補正蛍光(TCF)を求めます。
    TCF = スフェロイドのTCCF / (スフェロイドの面積 x スタック数)

結果

図 1.ImageJを使用した、スフェロイド中の目的タンパク質の免疫蛍光染色の定量のためのシーケンシャルステップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩(DAPI)	シグマ・アルドリッチ	D9542-10
6F12 抗ラミニンβ3サブユニットマウス(モノクローナル)			ホームメード
アルブミンフラクションV - BSA	アプリケム	A1391(英語
Alexa Fluor 488 ヤギ(ポリクローナル)抗マウス	インビトゲン	A11029 (英語)
Alexa Fluor 488 ヤギ (ポリクローナル) ウサギ	インビトゲン	A11034 (英語)
抗ラミニンγ2サブユニットマウス(モノクローナル)	サンタクルス	SC-28330
ベンチ遠心分離機	フィッシャーサイエンティフィック	50-589-620	芽
BM2抗ラミニンα3サブユニットマウス(モノクローナル)			Patricia Rousselle教授(CNRS、リヨン)のご厚意により提供されました。
遠心分離チューブ50 mL	コーニング	430290
共焦点顕微鏡	ツァイス
DMEM(高グルコース4.5 g / L)	ロンザ	BE12-604F
ヒト原発性膵臓線維芽細胞	ペロビオテック	PB-H-6201
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
顕微鏡スライド	サーモサイエンティフィック	J1800AMNZ
パラホルムアルデヒド	リーデル・ド・ハエン	16005
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	X100RS(エックス100RS