不可逆エレクトロポレーション:マウスの膵臓腫瘍を切除するための技術

要約

出典:Shankara Narayanan, J. S., et al.不可逆的なエレクトロポレーションの影響を研究するための同系膵臓がんマウスモデル。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、マウスの膵臓腫瘍の非熱アブレーションに対して不可逆的なエレクトロポレーション(IRE)を行う手順について説明しています。皮下腫瘍(SQ)腫瘍と同所性腫瘍はどちらも、高度に制御された環境でIREによる治療に成功し、処置後のさまざまな研究を容易にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とjove獣医審査委員会によって審査されています。

1. SQ腫瘍のIRE

1. 必要な材料を準備します:矩形波エレクトロポレーター、安全フットスイッチ、電極(ニードルアレイとピンセット)、アダプター。滅菌縫合糸(非吸収性4-0)、アルコール綿棒、バリカン、脱毛クリーム、アイ潤滑剤、綿ガーゼ、ブプレノルフィン、麻酔薬も近くに置いてください。
2. ピンセットまたはニードルアレイ電極をガス滅菌を使用して滅菌します。オートクレーブは推奨されません。ガラスビーズ滅菌器を使用して、動物間の電極を滅菌します。
3. SQ腫瘍インプラントが直径5mmに達したら、マウスに麻酔を成功裏に導入するための手順に従います。簡単に言えば、手術の30分前に、レシピエントマウス0.05〜1 mg / kgブプレノルフィン鎮痛SQを投与します。.次に、精密気化器(または他の麻酔薬)を使用して、酸素中の2〜3%イソフルラン(2 L / min)でレシピエントマウスに麻酔をかけます。処置全体を通して、マウスを37°Cの加熱パッドの上に置いてください。乾燥を防ぐために、目に潤滑剤を塗布してください。最初に驚くべき反射の欠如によって麻酔の深さをテストし、ペダル反射の欠如によって外科的平面麻酔を確認します 穏やかなつま先つま先つまみ。外科的処置全体を通して麻酔を維持します。
4. 麻酔をかけたマウスを横にして、側面のSQ腫瘍にアクセスします。バリカンで髪の毛を取り除き、アルコール綿棒で肌をきれいにします。
5. SQ腫瘍には、2本針アレイ電極を使用します。鉗子を使用して腫瘍部位の真下の皮膚を持ち上げ、電極を体と平行に皮膚を通して挿入し、電極が腹膜腔を貫通しないようにします。皮膚を通過したら、電極が腫瘍を囲むように電極を配置します。
6. エレクトロポレーターをプログラムして、1 Hzの周波数で1,500 V/cmで合計150パルスの100 μsパルスを送達します。フットペダルを使用してパルスを送達します。熱放散を可能にし、電極の正しい位置を確認するために、10パルスの各セットを10秒ずつ離します.
   手記：麻痺剤を使用しないと、マウスはIREによる筋肉の収縮を経験し、手動で固定しない限り電極の変位を引き起こす可能性があります。
7. 200秒を超えないように、完全な投与後に電極を取り外し、実際に供給された電圧を記録し、エレクトロポレーターに表示されます。マウスがIREに続いて回復するのを家のケージで許可し、食物と水に自由にアクセスできます。回復を容易にするために、ケージを加熱パッドに置きます。回復過程で、呼吸、灌流などのバイタルサインを監視します。マウスが回復したら、矯正反射の兆候を確認し、ケージ缶を通常のハウジングに戻します。ブプレノルフィン0.05〜0.1 mg / kgを手術後8〜12時間、および痛みの兆候がある場合は必要に応じて手術後8〜12時間ごとに投与します。.

2. 同所性腫瘍のIRE

>注:同所性腫瘍のIREは、同じマウスに対する2回目の生存手術を伴うため、開始前に地元のIACUCからの特別な承認が必要です。

1. 必要な材料を準備します:はさみ、メス、ニードルドライバー、先のとがった鉗子、平らな先端の鉗子などの手術器具をオートクレーブします。滅菌縫合糸(吸収性6-0および非吸収性4-0)、アルコール綿棒、バリカン、脱毛クリーム、アイ潤滑剤、綿ガーゼ、10%ポビドンヨウ素溶液、外科用ドレープ、加熱パッド、矩形波エレクトロポレーター、安全フットスイッチ、電極とそのアダプター、ブプレノルフィン、麻酔薬。
2. マウスの同所性腫瘍増殖をin vivo生物発光イメージングにより評価します。同所性移植後4日目から画像検査を行い、腫瘍の成長を追って、週に2回画像検査を行います。イメージング当日、イメージングの 10 分前に、麻酔 (酸素中の 2 - 3% イソフルラン (2 L/分)) レシピエント マウスに 30 mg/kg D-ルシフェリンを投与 (腹腔内注射) します。発光フィルターなしの発光設定を使用した発光設定を使用したルシフェラーゼ活性の画像 自己蛍光フリー加熱ステージを備えた発光イメージャーで、マウスの><麻酔を維持しながら、最低5秒間の露光。 手記：同所性腫瘍は、ルシフェラーゼ発光画像で見られるように、腫瘍がはっきりと見え、まだ膵臓に限定されている移植後8〜10日のIRE治療に理想的です
3. 手順に従って、埋め込まれた腫瘍を見つけます。簡単に言えば、手術の30分前に、レシピエントマウス0.05〜1 mg / kgのブプレノルフィン鎮痛SQを投与します。.精密気化器(または他の麻酔薬)を使用して、酸素中の2〜3%イソフルラン(2 L / min)でレシピエントマウスに麻酔をかけます。処置全体を通して、マウスを37°Cの加熱パッドの上に置いてください。乾燥を防ぐために、目に潤滑剤を塗布してください。最初に驚くべき反射の欠如によって麻酔の深さをテストし、ペダル反射の欠如によって外科的平面麻酔を確認します 穏やかなつま先つま先つまみ。外科的処置全体を通して麻酔を維持します。マウスを仰向けに置き、腹部の左側が露出するようにゆっくりと右側に回します。脱毛クリームを使用してマウスの腹部の毛を取り除き、ガーゼできれいにして、切開後に自由な髪が腹部に入らないようにします。10%ポビドンヨードを3サイクル使用し、その後アルコールワイプを使用して皮膚を消毒し、左腹部を手術用に準備します。滅菌メスを使用して、正中線の左側1 cm、胸郭の下、脾臓のわずかに内側に、皮膚に1.5 cmの横方向または斜めの切開を行います。次に、腹部の筋肉組織を通して切開部を伸ばし、その上にある表在性切開部を反映します。平らな先端の鉗子を使用して脾臓の位置を特定し、腹腔からゆっくりと外側にします。滅菌綿のアプリケーターを使用して脾臓を引っ込め、脾臓の底に付着した膵臓の尾を見つけます。先端が平らな鉗子を使用して、膵臓の尾部を横方向に引っ込めます。腫瘍を見つけるのが難しい場合は、鈍い鼻の鉗子を使用して胃を動かし、脾臓を穏やかに動かして腫瘍を特定します。
4. 鈍い鼻の鉗子で腫瘍を外部化し、ピンセットトロードのプラチナ電極で腫瘍をしっかりと捕捉します。ステップ1.7でプログラムされたとおりに、矩形波エレクトロポレーターを使用してエレクトロポレーションパルスを、フットスイッチで制御される10パルスのセットで送達します。
5. 出血の兆候を監視するために、IRE後少なくとも60秒間腫瘍を外部化したままにします。.腫瘍を腹腔内に戻し、説明に従って切開部を閉じます。簡単に言えば、6-0吸収性縫合糸を使用して腹部の筋肉組織を連続縫合または中断縫合で閉じ、3-0から6-0の非吸収性中断縫合糸を使用して上にある皮膚を閉じます。この時点で麻酔を中止してください。1.7. マウスが回復するまでマウスを監視します。
6. ステップ 2.2 に従って、in vivo ルシフェラーゼイメージングを使用して、腫瘍増殖に対する IRE の影響を監視します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ECM 830 矩形波エレクトロポレーター	ハーバード大学装置	BTX #45-0002 ( 58018-004 )
2ニードルアレイ電極	ハーバード大学装置	〒45-0167
安全フットスイッチ	ハーバード大学装置	〒45-0211
プラチナピンセットトロード	ハーバード大学装置	〒45-0486
イソフルラン	シグマ・アルドリッチ(株)	792632
ラクリルーブ	フィッシャーサイエンティフィック	19090646
ブプレノルフィン	フィッシャーサイエンティフィック	NC1292810
D-ルシフェリン	パーキン・エルマー	122799
IVIS Spectrum In Vivoイメージングシステム	パーキン・エルマー	124262
マウス C57BL/6J	ジャクソン研究所	000664/ブラック 6
BD Precisionglide シリンジ針	シグマ・アルドリッチ(株)	Z192406
アルコール綿棒(70%イソプロピルアルコール)	BDの	326895
使い捨てメス、滅菌済み	VWRの	21909
コットンチップアプリケーター	VWRの	89198
縫合針、45 cm、サイズ6-0	ハーバード大学装置	〒72-3308
縫合針、45 cm、サイズ4-0	ハーバード大学装置	〒72-3314
ポビドンヨード10%	BDの	29900-404
使い捨てウォーミングパッド	ケントサイエンティフィックコーポレーション	TP-3E
マウスバリカン	ケントサイエンティフィックコーポレーション	CL8787
外科用ドレープ	ハーバード大学装置	〒59-7421

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