磁気的にバイオプリントされた3Dスフェロイド共培養:癌細胞と線維芽細胞の共培養法

要約

出典:Noel P. et al.膵臓癌細胞および線維芽細胞の3次元スフェロイド共培養物の調製および代謝アッセイ. J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオでは、共培養された膵臓がん細胞と線維芽細胞の3D磁気バイオプリンティングについて説明しています。膵臓がん細胞と活性化した膵臓線維芽細胞を、生体適合性ナノ粒子集合体を用いて共培養・磁化し、磁力の影響下でスフェロイドを作製します。

プロトコル

1.磁気バイオプリンティングを用いた膵臓がん3次元スフェロイドの培養

1. 標準的な無菌組織培養技術を使用して、目的の細胞をT75フラスコで適切な増殖培地で70〜80%のコンフルエントまで培養します.
   手記：典型的には、70〜80%のコンフルエントT75フラスコから5〜7×10個の⁶細胞を採取した。この研究では、Patu8902(膵臓腫瘍細胞)とPS1細胞(活性化膵臓星状細胞)の2つの異なる細胞タイプが使用されました。両細胞株は、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、1×ペニシリン-ストレプトマイシン(p/s)を添加したロズウェルパークメモリアルインスティテュートの培地1640(RPMI-1640)で培養しました。
2. 細胞を5 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1回洗浄します。
3. 2mLの0.05%トリプシン-EDTAで37°Cで5〜10分間トリプシン化することにより、プラスチック表面から細胞を剥離します。
4. トリプシンを不活性化するために、分離した細胞に8mLの増殖培地を添加します。過度のトリプシン化は、細胞の健康/生存率に悪影響を及ぼす可能性があるため、避けてください。
5. 細胞を上下にピペットで動かして単一細胞懸濁液を生成し、自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞密度をカウントします。
6. その間に、NSのバイアルを周囲温度に平衡化します。
7. 必要な数のスフェロイド(ウェル)を播種するために必要な細胞の量を計算し、新しい15 mLコニカルチューブに分注します。例えば、96ウェルプレート全体に5,000細胞/ウェルを播種するには、少なくとも5.5細胞×10細胞5細胞を分注します。
8. 500 x gで3分間遠心分離して細胞を回収し、上清を慎重にスプレートまたはデカントし、細胞を1.0 x 10⁶細胞/mLの濃度で増殖培地に再懸濁します。せん断を避けるために、幅広の穴のピペットチップを使用して静かにピペットします。例えば、5.5 x 10⁵細胞を550 μlの増殖培地に再懸濁します。
9. 平衡化したNSを使用して、必要な量の細胞を磁化します(ステップ1.6)。
   1. 成長培地中の細胞懸濁液にNSを直接添加し、穏やかに攪拌します。細胞の効率的な磁気標識には、100 μL細胞あたり10 μL NSを使用します(1 x 10⁶細胞/mLで再懸濁)
      手記：一般的な実験では、550 μL中の5.5×10⁵ Patu8902細胞を55 μL NSで標識し、1.1×10⁶ PS1細胞を1100 μLで(別々に)110 μL NSで標識します。
   2. チューブを数回静かに反転させて、細胞の懸濁を確保します。一時的に、細胞-NSミックスを24ウェルプレートの1つのウェルに移します。これは、磁化される細胞タイプごとに個別に行います。プレートを覆い、室温で2時間インキュベートし、穏やかに振とうしてNSが細胞表面に結合できるようにします.
      手記：Patu8902またはPS1単独の細胞から開始するスフェロイドの培養とアッセイに加えて、磁気ドライブに印刷する前に両方の細胞タイプを事前に混合した共培養スフェロイドに加えて、独立した実験でこの方法を使用して成功裏に達成されました。Patu8902細胞およびPS2細胞から共培養スフェロイドを生成する方法は、以下のステップで説明される。
10. 磁化した細胞をピペで静かに上下させて均一に混合し、目的の細胞番号を含むマスターミックスを調製します。スフェロイドの播種には、合計15,000個の細胞(5,000 Patu8902 + 10,000 PS1)を使用し、96ウェルプレートのウェルあたり総容量150 μLに調整します><。 手記：各ウェルに分注される最終容量は、使用するセルの数に関係なく同じでなければなりません。
11. 96ウェル磁気スフェロイドドライブの上に96ウェル細胞忌避プレートを置き、150 μLの細胞ミックスを各ウェルに分注します。細胞が磁石の上のウェルの中心にゆっくりと集まるのを観察します。プレートを覆い、磁気スフェロイドドライブを取り付けたまま、37°Cにセットした5% CO₂インキュベーターで一晩インキュベートします。磁気ドライブを取り外し、最大7日間、さらなる増殖のためにインキュベートします.
    手記：磁気スフェロイドドライブを使用したスフェロイドプリンティングには、細胞撥水成長プレートを使用することが重要です。保持ドライブではなく、より薄い小さな磁石を備えた回転楕円体ドライブが使用されていることを確認してください。
12. スフェロイドの成長を毎日監視します。磁気保持ドライブに取り付けられた成長プレートを斜めに置き、マルチチャンネルピペットを使用して使用済み培地を引き出すことにより、3日ごとに新鮮な成長培地を補充します.
    手記：Patu8902とPS1細胞を15,000細胞/ウェルで共播種すると、5〜7日以内に直径400〜600μmの3Dスフェロイドに増殖します。この時点で、スフェロイドは代謝特性評価、薬物評価、およびその他のダウンストリームアプリケーションの準備が整っています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05%トリプシンEDTA	シグマ	〒25300-054
96ウェル細胞忌避プレート	USAサイエンティフィック/グリナーバイオワン	655970	スフェロイド成長プレート
セロメトリー セルカウンティングスライド	ネクセロム	CHT4-SD100-002
n3D磁気回転楕円体ドライブ	Nano3Dバイオサイエンス	655841	スフェロイドバイオプリンティングキットの一部
n3D磁気スフェロイドホールディング ドライブ	Nano3Dバイオサイエンス	655841	スフェロイドバイオプリンティングキットの一部
n3D ナノシャトル-PL	Nano3Dバイオサイエンス	655841	スフェロイドバイオプリンティングキットの一部: 4°Cで保存
Patu8902セル	ラボストック		膵管腺がん 細胞
PS1細胞	ラボストック		活性化された膵臓星細胞
RPMI1640	ギブコ	11875-093	細胞用増殖培地、スフェロイド