3Dスフェロイドにおける細胞外フラックスアッセイ:膵臓腫瘍スフェロイドの代謝活性を測定する方法

要約

出典:Noel, P., et al.膵臓癌細胞および線維芽細胞の3次元スフェロイド共培養物の調製および代謝アッセイ。J. Vis. Exp.(2017年)。

このプロトコルは、膵臓癌細胞（Patu8902）および活性化膵臓線維芽細胞）(PS1)の共培養から生成された3Dスフェロイドに対して細胞外フラックスアッセイを行う技術について説明し、解糖とミトコンドリア呼吸という2つの主要なエネルギー産生経路を測定する

ためのものです。

プロトコル

1. 細胞外フラックスアナライザーを用いた3D膵臓腫瘍スフェロイドの生体エネルギー経路の代謝アッセイ

>注:このセクションでは、3Dスフェロイド用に特別に設計されたアッセイマイクロプレートを備えた細胞外フラックスアナライザーを使用したスフェロイドの代謝機能の分析について説明します。

1. 成長プレートからスフェロイドアッセイマイクロプレートへのスフェロイドの洗浄と転写.
   手記：スフェロイドは、直径が~500 μmに達すると代謝アッセイに使用できます。
   1. アッセイを実施する前日に、付属のユーティリティプレートでプローブまたはセンサーカートリッジをアッセイキャリブラント(200 μL /ウェル)で水和し、37°Cに設定した加湿インキュベーター(非_CO2)で一晩(4〜18時間)インキュベー
   トします。
   2. 解糖ストレステスト(GST)アッセイ用の2 mM L-グルタミンまたはミトコンドリアストレステスト(MST)アッセイ用の1 mMピルビン酸、2 mM L-グルタミン、および10 mMグルコースをベース培地(材料表を参照)を補充することにより、目的の代謝アッセイに適したアッセイ培地を準備し>ます<。 手記：細胞外フラックス分析装置は、生細胞のミトコンドリア呼吸(OCR)と解糖系(ECAR)の両方を96ウェルプレート形式で測定します。これらの割合は、調査中のサンプルにおける細胞代謝機能の概要を提供します。詳細な手順については、アッセイキットのマニュアルを参照してください。
   3. アッセイ特異的サプリメントを添加した後(ステップ1.1.1を参照)、添加したアッセイ培地を37°Cのウォーターバスで温め、pHを0.1N NaOHで7.4±0.1に調整します。使用するまでミディアムを暖かく保ちます。
   4. キャリブレーションしたアッセイ培地でアッセイキット試薬を推奨ストック濃度に再構成します
      手記：これらは、井戸で必要な最終濃度の10×で作られます。グルコース、オリゴマイシン、2-デオキシグルコース(2-DG)のストック濃度は、それぞれ100 mM、100 μM、500 mMです。
   5. 成長板内のスフェロイドを光学顕微鏡で観察し、スフェロイドの形態と全体的な均一性、スフェロイドの形状と構造を確認します。
   6. 成長プレートを磁気保持ドライブに移し、~120 μL の成長培地を慎重に吸引します。スフェロイドを~120 μLの温めて事前にキャリブレーションしたアッセイ培地で穏やかに洗浄し、吸引して2回洗浄を繰り返します。スフェロイドが洗い流されていないことを確認するために、顕微鏡でスフェロイドを再度検査します。
   7. スフェロイドアッセイマイクロプレートを調製するには、各ウェルに180 μLの温かいアッセイ培地を加えます。
   8. P20マイクロピペットを10μLにセットし、幅広の穴あけチップを取り付けます。幅の広い穴の先端が利用できない場合は、通常のピペットの先端を清潔なはさみまたはメスで切り落とし、穴を広げます.
      手記：これにより、せん断が減少し、アッセイプレートに移される間、スフェロイドの全体的な形態が維持されるはずです。
   9. 暖かい(37°C)表面を使用して、スフェロイドの転写を行います。X線フィルムビューアの表面を白色光ランプで温めて、コントラストを高め、転写プロセス中のスフェロイドの視覚化を支援します。
   10. 幅広の先端が取り付けられたP20マイクロピペットを使用して、細胞忌避剤増殖プレートから事前に洗浄した単一のスフェロイドを慎重に吸引し、代謝アッセイを実施するためのスフェロイドアッセイプレートの各ウェルの中央に直接スフェロイドを静かに移します。各回転楕円体を純粋な重力で各ウェルの中央マイクロチャンバーに穏やかに落下させ、アッセイプレートに充填します
       手記：通常、各回転楕円体が重力によって井戸の中心に落ちるまでに5〜8秒かかります。スフェロイドがマイクロチャンバーに落ち着くまで、ピペットを引き抜かないでください。アッセイプレートの4つのコーナーウェル(A1、A12、H1、H12)はバックグラウンドウェルとして使用されるため、スフェロイドを沈殿させないでください。
   11. 各スフェロイドの形態と位置をモニターして、各スフェロイドが各ウェルの中心にあることを確認します。必要に応じて、ワイドボアピペットチップを使用してスフェロイドを吸引してウェルの中心に再配置し、その後重力で堆積させます。
   12. すべてのスフェロイドを移し替えたら、アッセイプレートを37°Cの加湿空気インキュベーター(非CO₂)に1時間置いてからアッセイします。
2. センサーカートリッジに化合物をロードし、アッセイを実施
   1. ステップ1.1.2で説明したアッセイ特異的培地に10×濃縮されたアッセイ特異的試薬を調製します。例えば、GSTを実施するには、グルコース、オリゴマイシン、および2-DGをアッセイマニュアルに記載されている推奨量で再構成します。GSTアッセイとMSTアッセイは、Patu8902-PS1スフェロイドを使用して実施しました。
   2. 左側にAHのラベルが付いた列でセンサーカートリッジの向きを正しく合わせ、センサーカートリッジの上部にローディングガイドを置きます。ロードするポートに対応する文字が左上隅に来るようにローディングガイドを向けることにより、目的のポートの正しいロードを確認します。
   3. マルチチャンネルピペットを使用して、試薬を直接注入ポートに分注します。手順全体を通して指先を使用してローディングガイドを所定の位置に保持します.
      手記：各試薬は、アッセイマニュアルに記載されている推奨ポートに注入されます。気泡を発生させないようにしますが、カートリッジのどの部分も軽くたたいて気泡を取り除かないでください。
   4. ローディングガイドを取り外し、カートリッジと目の高さに配置して、注入ポートを目視で検査し、均一なロードを実現します。
   5. セクション1.3で説明されているように、機器コントローラーのWaveソフトウェア(以下、解析ソフトウェア)を使用して、実験アッセイデザイン/機器プロトコルを作成します。
3. 解析ソフトウェアを使用したアッセイの設計と実行
   1. 実験用のアッセイテンプレートを作成
      1. 解析ソフトウェアを開き、「テンプレート」をクリックするか、既存のアッセイテンプレートから選択します。「空白のテンプレート」をダブルクリックします。
      2. 実験グループと条件を定義します。
         1. ポート A、B、C のインジェクション ストラテジーを定義します。ポート D は空のままにします。
            手記：GSTアッセイでは、これらのポートのみにグルコース、オリゴマイシン、および2-DGがロードされます。MSTアッセイの場合、オリゴマイシン、FCCP、ロテノンがロードされます。
         2. スフェロイドを1つ以上の試験化合物と対照群で処理した場合は、前処理を定義します。ソース、サプリメント、およびその他の情報を含むアッセイ培地を定義します。
         3. 密度と継代番号の情報を見て、1つ以上の細胞タイプ(Patu8902、PS1など)を定義します。
      3. 「Generate Groups」をクリックします。
      4. 「Plate Map」タブをクリックし、実験デザインに対応するアッセイプレートにグループを割り当てます。
      5. 背景ウェルとして 4 つのコーナー ウェルを選択します。これらのウェルにスフェロイドがないことを確認してください。
4. 分析装置でアッセイを実行
   1. 「Instrument Protocol」タブをクリックし、「Calibrate」、「Equilibrate」、「Baseline Measurement Cycle」にチェックを入れて、デフォルトのプロトコルコマンドをそのまま使用します。
   2. [Injections]をクリックし、各ポートの化合物を定義します。測定サイクルをスフェロイドのデフォルトの3サイクルから6サイクルに編集します。デフォルトの 3 min mix、0 min wait、および 3 min measure times.
      手記：デフォルトのミックス待機測定時間は、それぞれ 3 分、0 分、3 分です。通常、最初のアッセイ化合物を注入する前に、3つの基礎速度測定が行われます。これらの測定値は、実験計画に従って校正および再調整できます。
   3. プロトコルとグループの概要を確認します。
   4. アッセイデザインテンプレートを保存します。
   5. 注入ポートにアッセイ基質をロードしたら、アッセイ前のキャリブレーションに進みます。ユーティリティプレート付きのカートリッジを細胞外フラックスアナライザーに移します.
      手記：これは通常15〜20分以内に完了し、OCRおよびECAR測定を実行するためにセンサーを校正します。
   6. カートリッジのキャリブレーション後、ユーティリティプレートを3Dスフェロイドを含む予熱したアッセイプレートと交換し、アッセイを開始します。測定が完了したら、データをスプレッドシートまたはグラフ作成および統計ソフトウェアにエクスポートしてデータを分析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル細胞忌避プレート	USAサイエンティフィック/グリナーバイオワン	655970	スフェロイド成長プレート
D-グルコース	シグマ	D9434
DPBSの	ギブコ	14190-144
解糖ストレステストキット	アジレント・テクノロジーズ	103020から100
L-グルタミン	シグマ	59202Cさん
ミトコンドリアストレステストキット	アジレント・テクノロジーズ	103015から100
Patu8902セル	ラボストック		膵管腺癌細胞
PS1細胞	ラボストック		活性化された膵臓星細胞
RPMI1640	ギブコ	11875-093	細胞用増殖培地、スフェロイド
SeaHorse XFe 96 細胞外フラックス分析装置	アジレント・テクノロジーズ		細胞外フラックス分析装置
ピルビン酸ナトリウム	シグマ	S8636
XFベースメディア	アジレント・テクノロジーズ	102365から100	XFe 96 での代謝アッセイのベース培地