出典:Lonardo, E., et al.新しい治療戦略を開発するための膵臓がん幹細胞の特性の研究。J. Vis. Exp.(2015年)。
この記事では、ヒト膵管腺がん(PDAC)組織から膵臓がん幹細胞(CSC)を単離する技術について説明します。これらのCSCは、より効率的ながん治療を開発するためのCSCのin vitro自己複製能力に対する薬物治療の機能的影響を研究するために使用されます。
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方法論記事
PDAC幹細胞単離:膵臓腫瘍から癌幹細胞を単離する方法
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
1. ヒトPDACからのCSCの分離(図1)
- 滅菌バイオセーフティキャビネットで、ヒトPDAC組織を、1 mLの滅菌1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む60 x 15 mmの培養皿に移します。滅菌メスと鉗子を使用して、腫瘍を細かく刻みます(1〜5 mm)。
- 滅菌1X PBSの1mlを培養皿に加え、組織が完全に解離するまでトリチュレーションステップを繰り返します、これには通常3〜4ラウンドが必要です。組織懸濁液(1X PBSで最終容量5 mLまで補充)を滅菌チューブに移し、gentleMACSなどの解離剤で機械的に均質化します。
- 均質化した組織をコラゲナーゼ(1X PBSに2.5 mg/mlのコラゲナーゼを使用)で60分間、37°Cでインキュベートし、次いで900 x gで5分間遠心分離します。上清をデカントし、細胞ペレットを10 mLの完全培地に再懸濁します。細胞懸濁液を40 μmストレーナでろ過し、900 x gで5分間遠心分離します。
- 上清をデカントし、ペレットを5 mLの赤血球溶解バッファー(アンモニウム-塩化カリウム、ACK)で再懸濁し、
- ペレットをCSC培地に再懸濁し、ゼラチンでコーティングした皿にプレート付けし、37°Cで1時間インキュベートします。このステップにより、プレートに素早く付着する線維芽細胞のほとんどが除去されます。
- プレートをインキュベーターから取り出し、細胞懸濁液を慎重に回収し、血球計算盤を使用して生存細胞(トリパンブルー陰性)の数を定量化します。この目的のために、懸濁液とピペット20μlの懸濁液をエッペンドルフチューブに穏やかに混合します。20 μl (1:1比率) のトリパンブルーを微量遠心チューブ内の細胞に加え、よく混合します。混合物を約10 μlを血球計算盤にピペットで移します。
- 計数チャンバーの四隅の象限内のすべてのクリアセルをカウントし、生細胞数を確認します.
手記：細胞の生存率と収量は、腫瘍標本間でかなり異なる場合があります。PDACサンプルの場合、生存率は定期的に45〜70%の範囲であり、直径3〜5 mmの巨視的腫瘍サンプルからの組織片は、約5x106個の生存細胞をもたらすはずです。
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結果
図 1.メトホルミンはCSCを選択的に標的とします。
(A)メトホルミンは球のサイズを縮小しました。.指示用量のメトホルミンで7日間治療した後に得られた球体の代表的な画像(右パネル)。球体サイズ(n≥6)の定量化(左パネル)、横軸に示されている数字は個々の腫瘍を表しています。(B)メトホルミンの存在下または非存在下での球形成能力(n≥6)で、横軸に示された数字は個々の腫瘍を表します。(C)原発性膵臓癌細胞の二次および三次球におけるCSC自己複製能の代表的なグラフ。球体は、第1世代の球体形成中に合計7日間(n = 6)のみ処理されました。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| カウンティングチャンバー/ 血球計算盤 | ハウサーサイエンティフィック株式会社 | 3200 | |
| 増殖および生存率測定のためのCASYセルカウンターおよびアナライザー | ロシュ・イノバティス | AG CASY TTC モデル 45,60,150 μm | |
| GentleMACSディスソシエーター | ミルテニー株式会社 | 〒130-093-235 | |
| ジェントルMACS Cチューブ | ミルテニー株式会社 | 〒130-093-237 | |
| 100 mm組織培養皿 | BDファルコン | 353803 | |
| セルストレーナー | BDファルコン | 352350 | |
| 15mlポリプロピレンコニカルチューブ | BDファルコン | 352097 | |
| 50mlポリプロピレンコニカルチューブ | BDファルコン | 352070 | |
| 1.5ml滅菌チューブ | エッペンドルフ | 0030 120.086 | |
| 50mlの遠心分離管 | コーニング | 430828 | |
| 滅菌ペトリ皿、10cm皿 | コーニング | 353003 | |
| コラゲナーゼIV型 | 幹細胞技術 | 7909 | |
| RPMIミディアム1640 | ライフテクノロジー | 11875-085 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、100X | ライフテクノロジー | SV30010 | |
| L-グルタミン、200 mM、100X | ライフテクノロジー | 〒25030-081 | |
| B27 サプリメント 50倍 | ライフテクノロジー | 17504-044 | |
| 基本的な線維芽細胞成長因子 | シグマ | F0291 | |
| ダルベッコ モディファイドイーグル ミディアム/F12 | シグマ | D8437 | |
| 滅菌済み 1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 | シグマ | D8537 | |
| トリパンブルー | ライフテクノロジー | 15250-061 | |
| CO2インプットインプット付きインキュベーター | |||
| マイクロハサミ | |||
| 湾曲した鉗子 | |||
| スプリンター鉗子 |
