スフィア形成アッセイ:膵臓がん幹細胞およびスクリーニング療法を同定するためのIn vitro法

要約

出典:Lonardo, E. et al. 新しい治療戦略を開発するための膵臓がん幹細胞特性の研究。J. Vis. Exp.(2015年).

このビデオは、膵臓がん幹細胞スフェロイドをin vitroで開発するためのプロトコルを示しています。このアッセイは、がん幹細胞を標的とする可能性のある化合物を特定するためのスクリーニングツールとして機能します。

プロトコル

1.球体形成アッセイと分析

1. スフィア形成アッセイとメトホルミン治療
   1. 必要な数の細胞を取り出し、適切な量のCSCs培地を添加して、2,000細胞/mLの細胞濃度を調製します。細胞懸濁液を氷上に1時間以上保持せず、めっき前によく混合してください。
   2. 24ウェルプレートの最初と最後の列に500 μlの1X PBSを加えて加湿し、培地の蒸発を最小限に抑えます。1 mLの腫瘍球培地(2,000細胞/ ml)にウェルあたり2,000細胞の密度で細胞を超低接着細胞プレートに播種します
      手記：腫瘍球形成アッセイに使用される細胞の数は、腫瘍の種類によって異なる場合があります。
   3. 少なくとも 4 つのウェルをビヒクル (ネガティブ コントロール) で処理し、割り当てられた各処理で 4 つのウェル (例: 3 mM のメトホルミン) で処理します。細胞を37°Cに設定されたインキュベーターに入れ、細胞に5%_CO2を1週間供給します
      手記：腫瘍球の乱れのない形成を可能にするために培地を変更するべきではありませんが、成長因子は培養培地中で安定していないため、日常的に補充することができます。
   4. 隔日で、例えば、3 mMのメトホルミンまたはビヒクルを各ウェルに処理を追加します。より大きな構造のカウントを可能にする自動セルカウンターを使用して、5日後および/または7日後に形成された腫瘍球の数を評価します(図1).
      手記：少なくとも 40 μm の腫瘍球のみを考慮する必要があり、それぞれ小さい (40 - 80 μm) または大きい (80 - 120 μm) に分類できます。結果は、腫瘍球の割合をシードされた細胞の初期数(例、2,000細胞)で割ったものとして示すことができます。
2. 第一世代腫瘍球の連続継代
   1. 7日間のインキュベーション後、40μmの細胞ストレーナーを使用して腫瘍球を採取し、RTで900 x gで5分間遠心分離します。
   2. トリプシンを使用して腫瘍球のペレットを単一細胞に解離し、次に得られた単一細胞細胞懸濁液をさらに7日間再度拡大します。

結果

図 1.メトホルミン治療は、酸素消費を抑制し、ROS産生を誘導します。(A)メトホルミンはさらに、球状細胞の酸素消費(OCR)を阻害します。2つの異なるPDAC二次球をメトホルミンで処理し、OCRの変化を細胞外フラックス分析によって測定しました。ロテノン注射は、ミトコンドリアOCRの総消費量のコントロールとして使用されました。X軸は、酸素消費量(pmol of oxygen/hr)を各ウェルのタンパク質含有量で正規化した値です。(B)Aで使用したPDAC球をメトホルミンで8時間処理し、カルボキシ-DCFDAを用いたフローサイトメトリーによりROS産生を評価した。左:代表的なフローサイトメトリープロット。右、3つの独立した実験からのデータの要約。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェル超低アタッチメントプレート	コーニング	3474
滅菌済み 1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水	シグマ	D8537
メトホルミン	シグマ	D150959-5G
トリプシン溶液、0.05%	ライフテクノロジー	25300054
CO2インプットインプット付きインキュベーター
増殖および生存率測定のためのCASYセルカウンターおよびアナライザー	ロシュ・イノバティス	AG CASY TTC モデル 45,60,150 μm
カウンティングチャンバー/血球計算盤	ハウサーサイエンティフィック株式会社	3200
50mlの遠心分離管	コーニング	430828
15mlポリプロピレンコニカルチューブ	BDファルコン	352097
50mlポリプロピレンコニカルチューブ	BDファルコン	352070

名 円 さん