PTMベースの腫瘍微小環境モニタリング:腫瘍スフェロイドを使用してECM剛性の変化を追跡する方法

要約

出典:Jones, D. P., et al.粒子追跡マイクロレオロジーを使用した3D腫瘍モデルにおける細胞外マトリックスの剛性の縦断的測定。J. Vis. Exp.(2014年)。

このプロトコルは、粒子追跡マイクロレオロジー(PTM)を使用して細胞外マトリックスの剛性の変化を監視する技術について説明しています。これは、3D膵臓腫瘍スフェロイドをECMに培養し、蛍光プローブを埋め込み、ビデオ粒子の追跡と分析を行うことによって行われます。

プロトコル

1. ECMに埋め込まれた3D腫瘍スフェロイドの準備

1. 層流フード内に必要な材料を備えたワークステーションを準備します。
2. カルボン酸修飾された直径1 μmの蛍光トレーサープローブの希釈混合物を調製し、ストックプローブ2部(固形分2%)を25部の滅菌水に加えます。
3. 3.1 mg / mlの牛コラーゲンのボトルを冷蔵庫から取り出し、氷の上に置きます。.
4. 125 μlのコラーゲンを空の2 mLバイアルに分注します。
5. コラーゲンとボルテックスを短時間渦巻き、プローブを分配するために、希釈したトレーサープローブ溶液50 μlを添加します。
6. フェノールレッド (黄色に変わります) を含む適切な細胞培養培地235 μlを合計容量410 mLに加え、少しボルテックスした後、205 mL (全容量の半分) を取り出して新しい2 mLバイアルに入れます。バイアル 1 には腫瘍スフェロイドが含まれ、バイアル 2 は対照混合物になります。
7. 1 M NaOHをバイアル1に~2 μl加えて、溶液を中性pHに戻します(フェノールレッドを含む培地はレッドに戻るはずです)。これにより、混合物が氷上に保管されていない場合、混合物が硬化を開始することに注意してください。渦巻きにして一時的に混ぜ合わせ、すぐにアイスラックに戻します.
   手記：スフェロイドは、9日間の培養後、肉眼ではほとんど見えず、アガロースベッドからのスフェロイドの除去はデリケートな作業です。解剖顕微鏡の使用は、一部のユーザーにとって役立つ場合があります。移載中のスフェロイドの完全性を維持することは最も重要です。
8. 広口ピペットチップを使用して、腫瘍スフェロイドを含むウェルから40 μlの培地を静かに取り出します。この40μlを保持しながら、次のステップに進みます。
9. ウェルをチェックして、前の手順でスフェロイドが除去されたかどうかを確認します。そうであった場合は、スフェロイドを含む40μlをバイアル1に加えます。そうでない場合は、40μlをウェルに戻し、前の手順を繰り返します。
10. バイアル1を穏やかに攪拌し(ボルテックスのリスクはなく、スフェロイドを損傷する可能性があります)、混合物を60μlの部分で96ウェルプレートの3つの別々のウェルに移します。混合物を追加した後、顕微鏡で各ウェルを検査して、どのウェルにスフェロイドが含まれているかを決定します。
11. 1 M NaOHを~2 μl、および細胞培養培地40 μlをVial 2およびボルテックスに加え、この混合物60 μlを96ウェルプレートの空のウェルに分注し、コントロールとして標識します。
12. プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、少なくとも1時間硬化させます。

2. サンプルポイントのグリッドを作成し、各ポイントでビデオを撮影

します

1. サンプルプレートをインキュベーターから顕微鏡ステージに移します。加熱ステージが利用できない場合は、サンプルが室温と平衡化するまで10分間待ちます。
2. 低倍率の対物レンズでサンプルを観察し、サンプルが無傷でイメージングの準備ができていることを確認します。ウェル内の腫瘍の位置を決定します。
3. 取得するサンプルポイントの数を決定します。通常、各ウェルに20個のサンプルポイントがあり、回転楕円体の周りの同心円状のリングに分布していると、十分に詳細な結果が得られます。
4. ステージを各目的の位置に移動し、顕微鏡インターフェースソフトウェアを使用してx座標とy座標を記録します(インターフェースソフトウェアが利用できない場合は手動で座標を記録します)。
5. 顕微鏡を高倍率の対物レンズ(通常は100倍)に切り替え、トレーサープローブの励起波長に適したフィルターキューブを選択します。手順 2.4 で作成したポイントのリストを使用して、グリッド内の最初のポイントに移動します。
6. フォーカスを調整してウェルの底を見つけ、次に上に移動して、いくつかの焦点が合ったトレーサープローブを含む視野(fov)を見つけます。
7. 強度ヒストグラムを観察し、露出強度と時間を調整して、画像が飽和しないようにしながら、可能な限り最大のダイナミックレンジを提供します。
8. フレームあたり 20 〜 30 ミリ秒のフレーム レートでビデオ シーケンスを取得し (堅牢な MSD 計算に十分な統計を提供するためには、約 800 フレームまたは 16 〜 24 秒の長さが推奨されます。これは、各空間グリッド ポイントでの取得時間を最小限に抑える必要性とのバランスが取れています)、適切な規則で保存します。記録中は、顕微鏡やテーブルに触れないでください。
9. グリッド内の各サンプルポイントについて、手順2.6から2.9を繰り返します。
10. 実験の各ウェルについて、手順2.3から2.10を繰り返します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ1型コラーゲン	BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ	354231
PANC-1	American Type Cell Culture、バージニア州マナッサス	CRL1469	またはその他の適切な細胞タイプ
蛍光ミクロスフェア	Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド	906906
アガロース	Fisher Bioreagents、マサチューセッツ州ウォルサム	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents、マサチューセッツ州ウォルサム	NC0480985
96ウェルイメージングプレート	Corning Inc.、ニューヨーク州コーニング	3904
DMEM	ハイクロン、ウォルサム、マサチューセッツ州	01 SH30243日	または適切な細胞培養培地
Zeiss AxioObsever顕微鏡	ツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ		ハイスピードカメラとイメージングソフトウェアが付属

の 名 の