CRC細胞におけるホスファターゼアッセイ:結腸直腸癌細胞におけるタウタンパク質のリン酸化状態を調べる方法

要約

出典:Huda, M. N., et al.結腸直腸癌細胞におけるタウタンパク質の局在化に伴うリン酸化および微小管結合のためのアッセイ。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、結腸直腸癌細胞のホスファターゼアッセイによるタウタンパク質のリン酸化状態を評価するためのプロトコルについて説明しています。ホスファターゼ酵素は、タウタンパク質上に存在するリン酸基に作用し、未処理のタウタンパク質サンプルと比較して、SDS PAGEゲル上のタウタンパク質の移動度を高めます。

プロトコル

1. ホスファターゼアッセイ

1. 細胞が~65%のコンフルエンスに達したら細胞ライセートを処理し(顕微鏡法で近似)、MEMを添加した培地を取り出し、5 μM、10 μM、30 μMのクルクミンまたは25 mM、50 mM、100 mM LiClを含む無血清MEMを添加します。処理後24時間、5% CO₂を含む加湿雰囲気で37°Cで24時間インキュベートし、1 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、細胞スクレーパーを使用して細胞を掻き取ります。掻き取った細胞を1.5 mLの遠心チューブに移し、1,800 x g、4°Cで4分間遠心分離して、細胞ペレットを得ます。ペレットを100 μLの完全RIPAバッファーに4°Cで20分間懸濁し、チューブを定期的にタッピングしながら細胞を溶解します。サンプルを短時間超音波処理します。卓上遠心分離機で細胞ホモジネートを22,570 x g、4°Cで20分間遠心分離し、上清をピペットを使用して他の標識チューブに移し、アルカリホスファターゼ緩衝液中のアルカリホスファターゼを添加します。
   1. コントロールサンプルと処理サンプルの両方で、総タンパク質20 μgを含む20 μLのサンプルを調製します。総タンパク質20 μgを含む細胞ライセートを1液量添加し、続いて2 μLのアルカリホスファターゼバッファーと10 μLのアルカリホスファターゼを加えます。蒸留水を加えて20μLにします。
2. サンプルを37°Cで1時間インキュベートし、最終濃度50 mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加するか、最終濃度10 mMのオルトバナジン酸ナトリウム(Na₃VO₄)を添加して反応を停止します。反応は、75°Cで5分間加熱することによっても停止できます。
3. ホスファターゼとのサンプルのインキュベーションが終了する前に、ホスファターゼを添加せずに同じ濃度のサンプルを調製し、ホスファターゼ処理サンプルと比較します。
4. 新たに調製した4X SDSゲルローディングバッファーに400 mM DTTを添加します。
5. サンプルを100°Cのヒートブロックで5分間インキュベートし、ボルテックスを使用してサンプルを混合します。室温で10~15分間冷却します。
6. 10%ポリアクリルアミドゲルを泳動するための電気泳動システムをSDS-PAGEで組み立てます。
   1. 1ウェルあたり10 μgのタンパク質(13 μLサンプル)を10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。分子量ラダーをロードします。
   2. サンプルをロードした後、電気泳動システムの正極と負極を電源に接続して、一定の電圧を維持します。最初に、70 V で 20 分間開始し、タンパク質サンプルをスタッキングゲルから分離ゲルに移します。次に、電圧を125 Vに上げ、サンプルとタンパク質ラダーがゲルの端に達するまで、ゲルを約70〜120分間泳動します。
   3. 電気泳動が完了したら、湿式エレクトロブロッティングシステムを使用してゲルをPVDFメンブレンに移します。100 V で ~100 分間転送します。
   4. 分子量のはしごの側面に小さな切り込みを入れて、ブロットに印を付けます。透明なプラスチックシートと鋭利なカッターを使用して、ブロットをカットします。
7. メンブレンを4% BSAブロッキングバッファーで室温で90分間ブロッキングします。
8. ブロットを一次抗体溶液(抗タウ、1:5,000)で4°Cで一晩インキュベートします。ブロットをPBSTで4回、各7分間洗浄します。
9. 関連する二次抗体溶液(ヤギ抗マウスIgGを1:5,000)に調製し、ブロットを室温で90分間インキュベートします。PBSTで4回、各7分間洗浄します。
10. メーカーの推奨に従って、化学発光キットを使用してブロットを現像します。ブロットを透明なラップで覆います。化学発光イメージングシステムによる画像取得 化学発光
のためのソフトウェア。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HCT 116 セル	ATCCの	CCL-247
100mmディッシュ	コーニング	430161
MEM(EBSS)	ハイクロン	01 SH30024月
ウシ胎児血清(FBS)	サーモフィッシャー(Gibco)	16000044	-20°Cで保存
抗タウ13抗体	アブカム	AB19030
ジチオスレイトール(DTT)	ロシュ	10 708 984 001	保存温度 2–8 °C
クルクミン	シグマ・アルドリッチ(フルカ)	78246	保存温度 2–8 °C
抗タウ(リン酸化S396)抗体	アブカム	ab109390 (英語
FastAP感温性アルカリホスファターゼ	サーモサイエンティフィック	EF0651	-20°Cで保存
PMSFの	シグマ	P7626	室温で保存
ホスファターゼ阻害剤カクテル	細胞シグナル伝達	5870	4°Cで保存
プロテアーゼ阻害剤カクテル	細胞シグナル伝達	5871	4°Cで保存
ヤギ抗マウスIgG二次抗体	サーモフィッシャー	A-11005	暗所で4°Cで保存
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	アフィメトリックス	75819
分子イメージャー	バイオ・ラッド	ケミドックXRS+	4°Cで保存
RIPAバッファ	シグマ	R 0278	保存温度 2–8 °C
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	X - 100	約25°Cで保存
PVDFメンブレン	バイオ・ラッド	〒162-0177
ヤギ抗マウスIgG二次抗体	サーモフィッシャー	A-11005	暗所で4°Cで保存
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	アフィメトリックス	75819
プロテインアッセイ色素試薬	バイオ・ラッド	〒500-0006
ソニックメモリー	フィッシャーサイエンティフィック	モデル500
マイクロリットル遠心分離機	ヘティヒ・ゼントリフューゲン	マイクロ200 R

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