マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

Protocol

転写酵素反応を逆に

70から80への加熱ブロックを回し° Cと42℃水浴も、このステップで使用することができます。加熱ブロックを使用する場合、熱が均一になるように水を入れる。

1. プライミング反応
   1. RNAの3μgを取る
   2. RNaseフリーの水で13μlにボリュームを調整
   3. ランダムヘキサマープライマー（2mg/mL）2.5μlを加え、
2. よく混和して、8分間70〜80℃でインキュベートする。その後、氷上で5分間置きます。
3. RTカクテルを（14.5μL/ RXN）を準備します。
   
   

   コンポーネント	ボリューム
   5Xファーストストランドバッファー	6μlの
   0.1 M DTT	3μlの
   25Xアミノアリル- dNTPミックス	1.2μL
   のSuperScript II RT（200U/μl）	2.3μL
   水

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-アミノアリル)-2'デオキシウリジン-5'-三リン酸
dNTP		アマシャム	27-2035-01	100 mM dNTP セット PCR グレード
ランダム ヘキサマー プライマー		アマシャム	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		アマシャム	RPN5661	ポストラベリング反応性色素パック
QIAquick		Qiagen	28104	PCR精製キット
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	バッファー			1M リン酸バッファー (KPO4、pH 8.5-8.7) を組み合わせるには:9.5 mL 1M K2HPO4 と 0.5 ml 1M KH2PO4
リン酸塩洗浄バッファー				100 mL リン酸洗浄バッファー (5 mM KPO4、pH 8.0、80% EtOH) ミックス用: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ 水 + 84.25 mL 95% エタノール。洗浄バッファーは少し曇ります.** 重要:リン酸塩洗浄バッファーは毎日準備する必要があります。
リン酸溶出緩衝	液
				(Na2CO3):0.5M、pH 9.0で1 M KPO4、pH 8.5〜4 mMを希釈。4.2gのNaHCO3を80mLの滅菌水に溶解し、10NのNaOHでpHを9.0に調整します。滅菌水で最大100mLの容量を持ってきてください。色素カップリング反応用の50 mM溶液を作るには、水で1:10に希釈します。注:炭酸塩バッファーは時間の経過とともに組成が変化します。数週間から1か月ごとに新鮮にします。