宿主細胞因子がカポジ肉腫（KS）の確立と維持において重要な役割を果たす。我々は、KSHV感染DMVEC細胞に、とKS腫瘍組織に改変宿主細胞因子を特定する方法の概要を示します。ウイルスによって変更さ細胞の遺伝子は、新規な治療のための潜在的なターゲット（複数可）として機能します。
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この記事について
サマリー
要約
現在、KSは、南部アフリカで最も優勢なHIV / AIDS関連悪性腫瘍であり、それゆえ世界。1,2は、それが血管内皮細胞のangioproliferative腫瘍として特徴付けられると胸水のリンパ腫の形態では珍しいB細胞リンパ増殖性疾患（PEL）を生成と多中心性キャッスルマン病のいくつかの形態が。KSの細胞の 3〜5 1〜5％が積極的にカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、KSに関連付けられている病原体の溶菌複製をサポートしている病変、それは細胞因子が必要があることは明らかです。発癌と腫瘍の進行の過程におけるウイルス因子と相互作用。KS病理学に寄与する6,7の識別小説ホスト因子の決定要因は、KSの治療のための新たな治療薬を開発するなど、同様に腫瘍の進行や転移の予後マーカーを開発するために不可欠です。 dysregulated遺伝子をマイクロアレイ解析により識別されれば8付属のビデオの詳細我々はKSHV感染後、KS腫瘍組織における皮膚微小血管内皮細胞（DMVEC）に変更された宿主細胞の遺伝子発現プログラムを識別するために使用するメソッドは9、タンパク質発現の変化はイムノブロットおよびデュアルラベル付け免疫蛍光法によって確認した。調節不全の遺伝子の転写発現の変化を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量RT - PCR） により in vitro で確認されています。アーカイブKS腫瘍組織を用いた in vitroの結果での検証は、デュアル標識した免疫化学と組織マイクロアレイによって実行されます。8,10我々のアプローチは、in vitroで 、その後、in vivoモデル系での開発ができるようになりますKS腫瘍組織の微小環境での調節不全遺伝子を特定するKSの治療のための潜在的な新規治療薬の発見と評価。
プロトコル
1。 DMVECの栽培と感染をKSVH
- もともと人間の体の空洞に基づくリンパ腫から分離されたBCBL - 1細胞株は、、完全RPMI 1640培地（Gibco社、グランドアイランド、NY）中で培養する。 BCBL - 1細胞を、液体窒素から削除ドライアイスで輸送し、すぐに37℃で1分間のために解凍されている℃に密度1 × 10 4細胞/ mLの50μLの1 BCBL細胞のアリコートを10％ウシ胎児血清、1 ×ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地を500mLに加えて50 mL /フラスコで、175 cmのフラスコに配布されています。
- BCBL - 1細胞のフラスコは、その後37℃でインキュベートしている℃、5％CO 2の大気中のC細胞密度が3x106細胞/ mLに達するまで。溶菌サイクルのウイルス複製を0.3 ng / mLので20ng / mLのTPAと酪酸ナトリウムを添加することにより誘導される。
- 二十四時間後に誘導細胞（酪酸を削除する）ソーバルレジェンドRT遠心機で1500rpmで遠心分離して40mlの容積にPBS pH7.4ので2回洗浄され、誘導が20 ng / mLのでTPAを継続するさらに5日間RPMI 1640。
- セルフリーウイルスが単離され、分画遠心法により濃縮される。簡単に言うと、細胞と細胞の破片は4でソーバルRC - 6プラス遠心機で10,000 rpmでの最初のペレット℃で30分間。ウイルスを含む上清を25000 rpmで1時間4℃でベックマンコールターオプティマL - 90K超遠心分離で除去し、細胞遊離ウイルスをペレット化されています。
- ウイルスフリー上清を除去し、必要になるまで、ウイルスペレットは凍結媒体中に再懸濁し（10％ジメチルスルホキシドおよび90％ウシ胎児血清）、-80℃で保存されます。
主DMVEC細胞のKSHV感染。 - 継代レベル2-5でDMVEC細胞は、37 100x20mmの組織培養皿またはチャンバースライドで1 × 10 5の初期密度でプレーティングされ、そして（ロンザ、バーゼル、スイス）の完全EMB - 2メディアで維持されるの° C 5％CO 2の雰囲気。 80％コンフルエントで、DMVECはMOI 0.01の時に感染している、モック感染（メディアのみ）細胞をコントロールとして使用されています。新鮮な培地は2日毎に細胞に添加される。
- 紡錘細胞の形成によって説明したようにDMVECの細胞単層およびチャンバースライドは、感染の証拠のために毎日検査されています。紡錘細胞形成の最初の兆候（7〜14日）後、我々はメディアの変更を中止する。しかし、新鮮な培地を提供することなく、15〜21日間を超えるより長いインキュベーション時間は、培養皿を死んでたり、持ち上げ細胞で、その結果DMVEC細胞の整合性を損なう可能性があります。
- 感染時の最大ひょろ長いの時点で、細胞単層は、タンパク質やRNAの抽出のための細胞ペレットの調製のために収穫されます。チャンバースライド上で感染DMVEC細胞は、予め温めておいたPBSのpHが7.4を1 mL /ウィンドウで2回洗浄する。チャンバースライド上で細胞をPBS pH7.4で2倍の洗浄後に回収されています。それらはチャンバーを除去し、免疫蛍光染色（IFA）のために必要になるまで-20℃で開催された100％メタノールでスライドを配置する前に完全に乾燥させる。
2。モックとKSHV感染DMVECからのtotal RNA抽出およびcDNAの生産
- トータルRNAは、キアゲンRNesay Mini Kit（キアゲン、バレンシア、CA）を用いてKSHV感染DMVECとモック感染細胞から抽出されます。培養細胞ではRNAの分離に使用するソースである場合、動物の組織を処理するための製造業者のプロトコルは、均質化工程なしで採用されていますが。
- 取扱説明書の付録にある製造業者の推奨に従って、キアゲンRNAフリーDNaseキットを使用して列にDNAseI持つRNAを治療するために提供されるオプションを選択します。 DNAaseIは、RNA調製から混入ゲノムまたはウイルスDNAを分解する。 DNAseIの治療には、RT - PCR、定量RT - PCRやマイクロアレイ解析を含むダウンストリームのアプリケーションにとって重要です。
- RNAは洗浄緩衝液で指示し、残留エタノールに応じて洗浄してカラムの製造元が推奨する速度よりも一つ多くの時間を遠心分離によって除去される。残留エタノールは、溶出後のRNAの純度を損なう。
- RNAをカラムから溶出される前に最後の洗浄の後に追加の遠心分離工程が実行されます。 RNAは、RNaseフリー水30μLでカラムから溶出される。 RNAは、エッペンドルフAG - 6131バイオ吸光度計で定量及び純度分析されます。光学濃度の比（280分の260 nm）は、高純度のRNAのために典型的であるbetween1.8 - 2.0でなければなりません。
- マイクロアレイ解析のために、RNAは、RINのソフトウェアアルゴリズムを使用してAgilent 2100バイオアナライザで分析される。バイオアナライザでの解析は1〜10からのRNAの完全性番号（RIN）を提供します、しかし、RIN番号70から10からマイクロアレイや定量RT - PCR分析のための一貫性と信頼性の高い結果をもたらすことが証明されている。 RNAイゾラの平均RIN番号私たちの手でキアゲンRNAeasyキットとテッドは7.5から9の範囲である。
- RNAの定量は、カラムから10mMのトリス- EDTA pHが7.6の99μLに溶出されたRNAの1μLを加えることによって実現されます。 RNAとバッファーをピペットで混合し、エッペンドルフ、バイオ光度計で分光分析のためのクリーンなキュベットに追加されます。
- 各サンプルの1マイクログラムのメッセンジャーRNAは、高容量cDNAを逆転写キット（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州。）で逆転写する前に、製造元が提供するランダムヘキサマーを用いて準備されている。
cDNA合成 - 私たちはアプライドバイオシステムズから大容量cDNAを逆転写キットを使用すると、製造元の指示に従って進んでトータルRNAから一本鎖cDNAを合成する。
- 試薬の2倍のマスターミックスが行われ、10μLの体積のRNAの0.5〜1μgの2倍のマスターの試薬ミックス10μLに追加されます。結果として得られる1 ×溶液を穏やかに混合し、逆転写は、製造元の指示に従ってBIORAD MJミニthemalサイクラーで行われているさ。
- までのトータルRNAの二つマイクログラムまでは20μL反応ごとに使用することができます。 cDNAは、エッペンドルフAG - 6131バイオ光度計で260nmで定量化、および-80℃で保存Cまで、定量RT - PCRのために必要です。
3。モックとKSHV感染DMVEC細胞のマイクロアレイ比較分析
当研究室では、サービスごとの個別支払方式でヴァンダービルト大学医療センターマイクロアレイ共有リソースの中核施設で、マイクロアレイ解析を行います。我々は、感染制御の細胞をモックにKSHV感染DMVEC細胞の遺伝子の転写調節不全のための出力ファイルを比較。転移バイオマーカーを表す血管新生に関連するKSHV感染細胞、細胞増殖または転写調節不全の遺伝子をリアルタイムPCR、ウェスタンブロット、およびデュアルIFAを使用してKSHV感染DMVEC細胞を用いたin vitroで検証され、結果はアーカイブKS腫瘍の所見と比較されます組織。
4。モックとKSHV感染DMVECで検出された定量的RT - PCR転写解析調節不全遺伝子
- リアルタイムPCRは、cDNAを精製したRNAサンプルから発信されるとMyiQシングルカラーリアルタイムPCR検出システム（バイオラッド、ヘラクレス、CA）を使用して生成された逆転写酵素を用いて96ウェル光学プレート（ソレンソンバイオサイエンス社）で実行され、 25μL反応容量。この手順は、客室内に存在する可能性がある余分なDNA / cDNAが可能な汚染を避けるために、生物学的安全キャビネット内で行われます。
- マスターミックスの濃度で、SYBRグリーンスーパーミックス（バイオラッド、ヘラクレス、CA）と前方に選択されたと関心の各遺伝子のリバースプライマーを用いて、各プライマーセットの1.5 mlチューブ（製造業者の指示に従って）で調製するリボヌクレアーゼDNAaseフリーH 2 Oで行われたウェルあたり250 nmの、各サンプルは三重に行う必要があります。
- 宿主細胞の遺伝子の定量RT - PCR用プライマー配列は高度にKSHV感染DMVEC細胞およびKSの腫瘍で発現される核抗原に関連するウイルスの待ち時間であるKSHV LANA、のためのプライマー配列を含む。
- は10 ng /モック感染とKSHV感染DMVEC細胞からのUL株式のcDNAは、リボヌクレアーゼDNAase無料H 2 Oを使用して1時03分希釈され、この希釈の3μLを各ウェルに添加する。 cDNAのための対照ウェルの代替水。
- 96ウェルプレートは、ウェルの底に反応混合物を収集するために1000rpmで、室温で2分間穏やかに混合し、遠心分離、光学シールテープ（バイオラッドラボラトリーズ）によって封止されている。 Bio - Rad社MyiQ検知システムとランプは、実行を開始する前に、10分間のウォームアップを可能にするためにこの時点でオンになっています。
- Bio - Rad社製M iQのシングルカラーリアルタイムPCR検出システムに入れ、遠心分離96ウェルプレートは、その後、サイクルシーケンスのプログラムは、入力と保存、および実行が開始されます。
- サイクリングのシーケンスは以下の通りです：95℃で3分間、95℃15秒、60℃1分間、95℃1分間、55℃1分、および55℃で30秒Cに対するCのCのC 81サイクル合計。融解曲線は、プライマーの効率性のチェックとして、このプログラムに含まれています。 GAPDHのプライマーセットが増幅され、正規化のために含まれています。
- データ解析は、Bio - Rad iQ5光学システムソフトウェアのバージョン2を使用して行われます。
5。 KSHV感染DMVEC細胞の二重標識免疫蛍光分析
- 両方コンフルエント感染と感染していないDMVECを含むチャンバースライドが（チャンバーから削除）PBS pH7.4で2回洗浄し、空気が乾燥し、10分間、-20℃あらかじめ冷却した無水メタノールで固定し、-20℃で保持
- 細胞を用いたスライドは目です。エン空気が15分間乾燥し、5分間トリス生理食塩水（0.05MトリスpH7.4）を含有する氷のコプリンジャーに入れた。次いで細胞を37℃で1時間インキュベートしている° PBS pH7.4中1:50希釈（ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）に加え、ヤギポリクローナル抗体（1におけるKSHV LANAに対するモノクローナル抗体の混合物と加湿チャンバーのC： KSHV感染DMVEC細胞を用いたマイクロアレイによってdyregulatedことが判明した宿主因子タンパク質に対するPBS pH7.4の100倍希釈）。
- 次に、細胞をトリス生理食塩水（細胞が乾燥しても決して許さない）で3回洗浄し、その後に結合したローダミン赤- Xとロバ抗ヤギ抗体を結合させた二次ロバ抗マウスIgG抗体の混合物で30分間インキュベートするFITC（ジャクソンイムノ、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）、PBSで1:100希釈で両方。
- 細胞は、後でコプリンジャーにトリス生理食塩水で3回洗浄され、スライドがまだ湿っている間、スライドを1.5 g / mlのDAPIのとカバースリップを含むVectashieldマウンティングメディア（ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）でマウントされています。
- 蛍光が観察され、ニコンTE 2000S蛍光顕微鏡で撮影した画像は、電荷結合素子（CCD）カメラを搭載しています。写真は、200倍の総合倍率用20倍対物レンズを用いて行われます。
- DAPI（200X）、のために使用されているのと同じ倍率で別々の写真は、ローダミンとFITCのための青フィルターのための緑のフィルターで、usinge UV照明を取られます。画像は後でニコンのフリーウェアソフトウェアを使用してマージされます。
6。 KSHVラナと内皮細胞マーカーPecam-1/cd31用Ksの組織とKSの組織マイクロアレイ上でデュアルラベル免疫組織化学
- デュアル標識した免疫組織化学は、KSHV LANAとウイルス感染後に変更に見られる宿主細胞のタンパク質のDAKOストレパビジンABCのデュエット染色キットを使用して実行されます。 IHCは、ホルマリンで固定アーカイブAIDS - KSの組織で実行し、パラフィンに埋め込まれています。
- 5ミクロンの切片をミクロトームで切断し、前の免疫染色にchemateのスライド上に配置されています。
- パラフィン包埋のスライドは、ヒュームフードの下で10分間、キシレンでdeparaffinzedし、細胞は100％、95％、および5分ごとに70％の段階的エタノールシリーズで水和されている。スライドはその後、抗原のアンマスキング（また、抗原の検索とも呼ばれる）に先立って10分間水中に配置されます。
- 免疫染色のために、抗原のアンマスキングは、15分間95℃で50mMクエン酸pH6.0の緩衝液中で電子レンジで実行されます。簡単に言うと、を含む細胞を直ちに室温で開催された蒸留水に入れ、15分間95 ° Cのクエン酸緩衝液中に浸漬されているスライド。
- 内因性ペルオキシダーゼの焼入れは、焼入れ液で30分間スライドをインキュベートすることによって行われます。簡単に言えば、50 mLコニカルチューブに95％エタノール47 mLを加え、60 mLの合計は11.2 mLのPBSのpHは7.4と3％過酸化水素1.8 mLを加える。
焼入れ液を使用直前に行われます。 - 次に、細胞を室温で5分間ずつPBS pH7.4で3回洗浄されています。ブロッキング溶液（95％エタノール12.5 mLを、正常ヤギ血清1.4mlを、140 mgのウシ血清アルブミン、および2滴のTween20）抗体の非特異的結合を防ぐために用意されています。使用前に氷上に置きます。 （このブロッキング溶液は4℃で保存することができます℃、最大1週間）。
- ブロッキング溶液をスライドに検体に添加し、その後パラフィンのストリップで覆われ（試料の乾燥を避けるために）と加湿チャンバーに入れ、室温で1時間インキュベートする。
- ウイルス抗原に対する一次モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、1:50希釈でブロッキング溶液中で調製、ピペットで混合し、必要になるまで氷の上に配置されます。抗体溶液の50〜100μLの試料の大きさやスライドの数に応じて組織標本ごとに必要となります。
- 直ちにインキュベーション後にブロッキング溶液をスライドをオフ振とうすると一次抗体の50〜100μLは、パラフィンのストリップで覆われている組織標本に追加されます。検体は室温で加湿チャンバーで1-2時間インキュベートする。
- 標本を含むスライドはその後PBS pH7.4中、それぞれPBS pH7.4中1:100希釈で二次ビオチン化ヤギ抗マウス抗体を加え、30室温で加湿チャンバー中でインキュベートされるまで5分間3倍の洗浄されています - 45分。
- 約30分使用する前に、PBS pH7.4中共役-ストレプトアビジンペルオキシダーゼが用意されています。 DAKOのサイトメーションのデュエットのキットを使用して、PBS pH7.4の、ボルテックスして、再度溶液Bとミックス50μLを追加し、5 mLの溶液50μLを加える。
- 完全にステップ6.10での抗体のインキュベーション後、スライドをPBS pH7.4で3回洗浄し、新鮮なPRされていますepared西洋ワサビペルオキシダーゼ共役 - ストレプトアビジンのソリューションは、加湿チャンバー内で30〜45分を添加し、室温でインキュベートする。
- インキュベーション後、スライドを室温でPBS pH7.4で3回洗浄されています。洗浄前に5分は、3,3 - ジアミノ - ベンジジン（DAB、SIGMA）基質溶液（PBS pH7.4の、3％過酸化水素25μL、及び1 DABタブレットの20mL）を準備される完了です。 DABタブレットが完全に溶解した後、茶色がかった色の溶液を0.45ミクロンのシリンジフィルターで濾過する。感染細胞におけるKSHV LANAのための最終的な洗浄と発色がニコンエクリプスE200顕微鏡を用いて、明視野でのリアルタイムで観察された後、フィルタ処理されたDAB溶液を試料に追加されます。希望の色の開発が達成されると、反応は5分間蒸留水でのインキュベーションによりクエンチされる。
- デュアルラベル付けIHCの場合は、水の中でのインキュベーション後に標本を含むスライドは、抗原の検索のステップ（6.4）から始まる二度目のIHCプロトコルを介して配置されます。その中のペルオキシダーゼ基質のステップ（6.11）の代わりに、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役 - ストレプトアビジン、ストレプトアビジンコンジュゲートが採用されているアルカリホスファターゼでしかしプロトコルの変更
- 第二標識は、上述したように電子レンジでの追加の抗原の検索のステッププラス（ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）調節不全であることが判明細胞タンパク質に対するモノクローナル抗体で2番目の免疫染色することによって達成される。細胞は、その後、洗浄した後、1:500希釈でアルカリホスファターゼ-ストレプトアビジン複合体（ベクター研究所、バーリンゲーム、カリフォルニア州）に続いて1:100希釈でビオチン化ヤギanti-mouse/rabbit IgG抗体（DAKO）でインキュベートする。発色は、製造元の指示に従ってベクトルレッドアルカリホスファターゼ基質キット（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を用いて基板のベクトル赤で細胞をインキュベートすることによって達成されます。対比染色は、必要に応じて、orecinまたはヘマトキシリンで行うことができます。組織標本は、恒久的にカバーガラスとpermountマウントメディアでマウントされています。画像は、CCDカメラでマウントニコンTE - 2000S顕微鏡で明視野照明下で撮影されています。
7。 DMVEC細胞のアデノウイルスの形質導入による遺伝子デリバリー
- 正常DMVEC細胞はチャンバーEBM - 2の完全メディア当たりの密度2.5 X10 5個の細胞のメッキでチャンバースライドで栽培されています。
- DMVEC細胞は、アデノウイルス5 UL /チャンバースライドウィンドウは力価1X 10 10粒子/ mLのEGFPを発現した後80％コンフルエント（3-5日撮影）に栽培されています。
- アデノウイルスが追加されたDMVEC細胞培養を生きるには、ウイルスを追加した後にEGFPの蛍光18時間を調べた。
- 個々の位相と蛍光写真は200Xの総合倍率で撮影し、CCDカメラでマウントNIKON TE 2000S蛍光顕微鏡に統合された。
8。代表的な結果
図1。ロンザ社からプライマリDMVEC細胞はEBM - 2培地で維持されたとMOI 0.01でBCBL - 1ウイルスに感染させた。感染DMVECの細胞単層が毎日調べた後。十日後に感染モック感染細胞は敷石状の形態を示し、KSHV感染細胞は、紡錘状の内皮細胞の紡錘細胞型の形態の特徴は、KS腫瘍組織にKSHVに感染して見られる展示。写真は、100Xの合計倍率CCDカメラでマウントNIKON TE 2000S顕微鏡で撮影された。
図2。デュアルラベル付け間接免疫蛍光染色は10日、感染後におけるKSHV感染DMVEC細胞を行った。感染細胞はKSHV LANAとKSHV感染後は、変更することにある特定の宿主細胞のタンパク質にヤギポリクローナル抗体に対するモノクローナル抗体との二重染色した。二次ロバ抗マウスおよびローダミンとFITCの結合ロバ抗ヤギ抗体の混合物が追加されました。細胞は、CCDカメラを搭載したニコンTE2000S蛍光顕微鏡で調べた。 DAPIで取り付けメディアは、核を可視化するために使用された。すべての写真は200倍の総合倍率で撮影したもの。核へのローカライズされたウイルスLANAタンパク質を（ローダミン染色）を発現する感染細胞は、細胞質へのローカライズされた宿主細胞特異的タンパク質（FITC染色）の発現低下を示しています。
図3。 LANAとPECAM - 1 / CD31用KS腫瘍組織のIHC。エイズKS腫瘍組織は、KSHV LANAとPECAM - 1 / Cのために、シングルおよびデュアルラベル付けIHC染色したD31。 A）KS組織がLANAするモノクローナル抗体で染色し、ヘマトキシリンで対比表示します。 LANA陽性細胞は、白い矢印で識別されます。 B）。 KS組織はPECAMI/CD31するモノクローナル抗体で染色し、染色は、白い矢印で示されている血管周囲血管内皮に特異的に表示されます。 C）CD31に対して陽性染色細胞に対するLANA白のための黒の矢印で示されているLANA（ベクトル赤）とCD31（茶色）のためのKS組織デュアルステンドを表示します。 D）パネル用下部パネルC.明視野画像で同じスライドから面積の倍率600倍ACの総合倍率でNIKON TE2000S顕微鏡で撮影されたと200xを表示D.
図4。感染制御の細胞をモックと比較して定量RT - PCRの10日後の感染によるKSHV LANAの時間的な発現が。KSHV感染DMVECセルのすべての値は、GAPDHに正規化された。モック感染細胞のLANA cDNA増幅の証拠はなかった。
図5。 KS腫瘍組織マイクロアレイ。組織マイクロアレイ（TMA）は、単一のスライドに配列された0.6ミリメートル組織のコアを表します。各組織のコアは、異なる患者からKS腫瘍の標本を表します。 TMAは、オハイオ州立大学のレオナエアーズMDからエイズのがん標本資源（ASCR）を通じて利用可能でした。健常および陽性対照組織と一緒にパラフィン包埋KS腫瘍組織は、ガラススライド上に置いた。 KSの組織標本は、口、皮膚、軟口蓋、舌、頸部の腫瘤から採取した。すべての患者がHIV陽性であった。
図6。組織マイクロアレイは、免疫組織化学によるKSHV LANAのために染色し、明視野顕微鏡により分析した。LANAのための発色は、ペルオキシダーゼの基質としてDABを使用して実行し、LANA陽性細胞は、強烈な茶色の染色パターンにより可視化されたされた。ウイルス負荷と紡錘細胞領域の異なる量を観察することができます。 A）腫瘍の定義済み領域の焦点ウイルス感染を表します。 B）とほぼ現在の紡錘形細胞の数と相関関係が高いウイルス負荷と播種性感染を表します。ステンド組織のコアは200倍の倍率で観察された。
図7。よく当たり2.5 X10 5細胞の密度でEBM - 2の完全なメディアで培ったDMVEC細胞は1.0 × 10 10の力価でアデノウイルスの5μLで形質導入した。細胞がEGFP蛍光18時間後の形質導入のために検討した。位相と蛍光画像の両方は、200Xの総合倍率でニコンTE 2000S顕微鏡で撮影した。主DMVEC細胞のトランスフェクションは、我々は、私たちは主DMVECでフィブリン- 2とgaletin - 3の非常に効率的に提供できるようになるウイルスベクターを特定しているため、問題があることが証明されています。我々は、EGFPを発現するアデノウイルスを効率的に主要なDMVECを伝達できることがわかった。また、我々はLentigen株式会社から取得したレンチウイルスベクターは、プライマリDMVECセルを（データは示さず）形質導入のための同じように効率的であることがわかった。
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ディスカッション
このレポートで使用されている手法は、実験室のさまざまな設定で行うことができます。彼らはいくつかの特別な機器やコア施設へのアクセスが必要です。 biosafteyレベル3（BSL - 3）施設の使用が必要な場合がありますKSHVのような感染性ウイルス性病原体が関与する実験を行うときに適切な予防措置が取られている必要があります。組織の買収は、適切な制度審査委員会（IRBの）によって承認されなければならない。
これらの方法論は、一緒にin vitroでの発現に調節不全および in vivoならびに遺伝子発現プロファイルの検証内皮細胞での遺伝子送達のための戦略のために定義されたメソッドを提供している遺伝子を同定するための基礎を提供することができます。一緒にこれらの知見は、特定のウイルス遺伝子が続いてKSHV感染により影響を受けるとされている生化学的経路の解明に役立つことがあります。 KSHVのような発癌性ウイルスは特定の分子経路を中断する方法についての理解は、新規治療薬の開発に洞察を提供することができます。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
我々は彼のアドバイスとこの原稿の見直しのためにジェームズEKヒルドレス、メハリー医科大学を、感謝。我々はまた、原稿の編集にダイアナマーバーに感謝。エイズの健康格差研究センター、NIHの助成金5U54 RR019192 - 05;臨床研究のためのメハリーセンター、NIHグラントP20RR011792、この作品は、エイズ研究のためのメハリーヴァンダービルトセンター（NIHの助成金P30 AI054999 - 05）によってサポートされ、NIHで助成金P01 CA113239。 DJAは部分的にエイズ研究のためのヴァンダービルト - メハリーセンター（CFAR）と臨床研究のためのメハリーセンター（CRC）からのパイロットの補助金によって賄われていた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| 酪酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2培地 | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits サプリメント |
| DMVEC細胞 (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| 胎児ウシ血清 | Hyclone | SH30066.03 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Invitrogen | 15140-122 | |
| チャンバースライド | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50希釈/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| ドンキー抗ヤギ FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| ドンキー抗ヤギ Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100希釈/IFA |
| 封入剤 | Vector Laboratories | H 1500 | DAPI含有Vectashield |
| BCAタンパク質定量アッセイキット | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| ニトロセルロース | Bio-Rad | 161-0112 | |
| ドンキー抗ヤギ複合体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| ウェスタン基質 | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| ビオチン化ウサギ抗ヤギ | Dako | 305-065-045 | |
| AP-ストレプトアビジン複合体 | Dako | K 0492 (キット) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| バイオフォトメーター | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus 遠心機 | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K 超遠心機 | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler リアルタイムPCR検出システム | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S 蛍光顕微鏡 | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT 遠心機 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
参考文献
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
- Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
- Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
- Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
- Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma. Glycobiology. , (2009).
- Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
- Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).
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