宿主細胞因子がカポジ肉腫（KS）の確立と維持において重要な役割を果たす。我々は、KSHV感染DMVEC細胞に、とKS腫瘍組織に改変宿主細胞因子を特定する方法の概要を示します。ウイルスによって変更さ細胞の遺伝子は、新規な治療のための潜在的なターゲット（複数可）として機能します。
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この記事について
サマリー
要約
現在、KSは、南部アフリカで最も優勢なHIV / AIDS関連悪性腫瘍であり、それゆえ世界。1,2は、それが血管内皮細胞のangioproliferative腫瘍として特徴付けられると胸水のリンパ腫の形態では珍しいB細胞リンパ増殖性疾患（PEL）を生成と多中心性キャッスルマン病のいくつかの形態が。KSの細胞の 3〜5 1〜5％が積極的にカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、KSに関連付けられている病原体の溶菌複製をサポートしている病変、それは細胞因子が必要があることは明らかです。発癌と腫瘍の進行の過程におけるウイルス因子と相互作用。KS病理学に寄与する6,7の識別小説ホスト因子の決定要因は、KSの治療のための新たな治療薬を開発するなど、同様に腫瘍の進行や転移の予後マーカーを開発するために不可欠です。 dysregulated遺伝子をマイクロアレイ解析により識別されれば8付属のビデオの詳細我々はKSHV感染後、KS腫瘍組織における皮膚微小血管内皮細胞（DMVEC）に変更された宿主細胞の遺伝子発現プログラムを識別するために使用するメソッドは9、タンパク質発現の変化はイムノブロットおよびデュアルラベル付け免疫蛍光法によって確認した。調節不全の遺伝子の転写発現の変化を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量RT - PCR） により in vitro で確認されています。アーカイブKS腫瘍組織を用いた in vitroの結果での検証は、デュアル標識した免疫化学と組織マイクロアレイによって実行されます。8,10我々のアプローチは、in vitroで 、その後、in vivoモデル系での開発ができるようになりますKS腫瘍組織の微小環境での調節不全遺伝子を特定するKSの治療のための潜在的な新規治療薬の発見と評価。
プロトコル
1。 DMVECの栽培と感染をKSVH
- もともと人間の体の空洞に基づくリンパ腫から分離されたBCBL - 1細胞株は、、完全RPMI 1640培地（Gibco社、グランドアイランド、NY）中で培養する。 BCBL - 1細胞を、液体窒素から削除ドライアイスで輸送し、すぐに37℃で1分間のために解凍されている℃に密度1 × 10 4細胞/ mLの50μLの1 BCBL細胞のアリコートを10％ウシ胎児血清、1 ×ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地を500mLに加えて50 mL /フラスコで、175 cmのフラスコに配布されています。
- BCBL - 1細胞のフラスコは、その後37℃でインキュベートしている℃、5％CO 2の大気中のC細胞密度が3x106細胞/ mLに達するまで。溶菌サイクルのウイルス複製を0.3 ng / mLので20ng / mLのTPAと酪酸ナトリウムを添加することにより誘導される。
- 二十四時間後に誘導細胞（酪酸を削除する）ソーバルレジェンドRT遠心機で1500rpmで遠心分離して40mlの容積にPBS pH7.4ので2回洗浄され、誘導が20 ng / mLのでTPAを継続するさらに5日間RPMI 1640。
- セルフリーウイルスが単離され、分画遠心法により濃縮される。簡単に言うと、細胞と細胞の破片は4でソーバルRC - 6プラス遠心機で10,000 rpmでの最初の....
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ディスカッション
このレポートで使用されている手法は、実験室のさまざまな設定で行うことができます。彼らはいくつかの特別な機器やコア施設へのアクセスが必要です。 biosafteyレベル3（BSL - 3）施設の使用が必要な場合がありますKSHVのような感染性ウイルス性病原体が関与する実験を行うときに適切な予防措置が取られている必要があります。組織の買収は、適切な制度審査委員会（IRBの）によって承認されなければならない。
これらの方法論は、一緒にin vitroでの発現に調節不全および in vivoならびに遺伝子発現プロファイルの検証内皮細胞での遺伝子送達のための戦略のために定義されたメソッドを提供している遺伝子を同定するための基礎を提供することができます。一緒にこれらの知見は、特定のウイルス遺伝子が続いてKSHV感染により影響を受けるとされている生化学的経路の解明に役立つことがあります。 KSHVのような発癌性ウイルスは特定の分子経路を中断する方法についての理解は、新規治療薬の開発に洞察を提供することができます。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
我々は彼のアドバイスとこの原稿の見直しのためにジェームズEKヒルドレス、メハリー医科大学を、感謝。我々はまた、原稿の編集にダイアナマーバーに感謝。エイズの健康格差研究センター、NIHの助成金5U54 RR019192 - 05;臨床研究のためのメハリーセンター、NIHグラントP20RR011792、この作品は、エイズ研究のためのメハリーヴァンダービルトセンター（NIHの助成金P30 AI054999 - 05）によってサポートされ、NIHで助成金P01 CA113239。 DJAは部分的にエイズ研究のためのヴァンダービルト - メハリーセンター（CFAR）と臨床研究のためのメハリーセンター（CRC）からのパイロットの補助金によって賄われていた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| 酪酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2培地 | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits サプリメント |
| DMVEC細胞 (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| 胎児ウシ血清 | Hyclone | SH30066.03 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Invitrogen | 15140-122 | |
| チャンバースライド | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50希釈/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| ドンキー抗ヤギ FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| ドンキー抗ヤギ Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100希釈/IFA |
| 封入剤 | Vector Laboratories | H 1500 | DAPI含有Vectashield |
| BCAタンパク質定量アッセイキット | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| ニトロセルロース | Bio-Rad | 161-0112 | |
| ドンキー抗ヤギ複合体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| ウェスタン基質 | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| ビオチン化ウサギ抗ヤギ | Dako | 305-065-045 | |
| AP-ストレプトアビジン複合体 | Dako | K 0492 (キット) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| バイオフォトメーター | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus 遠心機 | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K 超遠心機 | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler リアルタイムPCR検出システム | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S 蛍光顕微鏡 | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT 遠心機 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
参考文献
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J.....
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再版と許可
