Bicyclus anynanaの蛹の翼の組織における遺伝子発現を調べるために、我々はリボプローブを用いてサイチュハイブリダイゼーションのために最適化されたプロトコルを提示する。我々はまた、他のチョウ目の種の蛹の翼で使用するためにこのプロトコルのさらなる最適化のためのガイドラインを提供しています。
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この記事について
サマリー
要約
ここでは、ビデオフォーマットで、リボプローブを使用して蝶Bicyclus anynanaの蛹の翼のサイチュハイブリダイゼーションのためのプロトコルを提示する。サイチュハイブリダイゼーションでは、発生生物学の主流は、転写レベルでの組織を開発する際に遺伝子発現の空間的および時間的パターンを研究するのに便利です。遺伝子の転写のタンパク質産物はまだ開発、および/または内臓で、入手可能な抗体を用いて区別することができないゲノムの特定のタンパク質の複数の遺伝子のコピーが存在していないターゲット抗体が代わりに使用することができる場合。幼虫の翼のディスクの現場テクニックで数年間、蝶のコミュニティに利用されていますが、現在のプロトコルは、より大規模で脆弱な蛹の翼のために最適化されています。
プロトコル
1日目
- 以下のソリューションを準備します。
- 10倍PBS
- 1X PBS
- 1X PBT
- のddH 2 O
- 0.1パーセント合計ボリュームに対して、DEPCを追加し、積極的にソリューションを振る。
- オートクレーブ。
- 4％パラホルムアルデヒド修正 - PBS - DEPCを使用して
- プロテイナーゼK溶液 - アリコートを取り外す前に、精力的に沈殿物が存在する場合には、渦
- 消化ストップバッファー
- プレハイブリダイゼーションバッファー
- 50:50 PBT：プレハイブリダイゼーションバッファー
- ハイブリダイゼーションバッファー
- ソリューションは、RNaseフリーに保つ必要があります。どちら焼きされたガラスウエア（250で4時間° C）または使い捨てのプラスチックを使用してください。血清学的ピペットは、ソリューションを構成するために非常に便利です
- PBS中で蛹を上演時から翼を解剖する
- 室温で24穴培養プレートのウェルにバッファを修正するために直接翼を移動する
- 2時間のディスクを修正
- PBTで5 × 5分間洗浄
- プロティナーゼK溶液で3分間の翼をインキュベート
- 消化ストップバッファーで2 ×をすすぐ
- PBTで5 × 5分間洗浄
- PHB：50:50 PBTの2 × 5分間洗浄
- PHBの1 × 10分間洗浄
- 55 PHB少なくとも1時間のインキュベート℃の
- 熱変性RNAプローブ（20 - 50ngよくごとに必要な）（80℃で5分間）とハイブリダイゼーション緩衝液（100μlのウェル毎に必要）に追加
- ウェルにプローブを追加し、55℃で48時間インキュベート° C
3日目
- 55で4 × 5分間洗浄° C PHB
- 55 PHBで一晩インキュベート° C
4日目
- 以下のソリューションを準備します。
- 抗体のブロックバッファ
- PHB：50:50 PBTで1 × 5分間洗浄
- PBTで4 × 5分間洗浄
- 4のブロックバッファ内で1時間インキュベート翼は° C
- 一晩4抗DIG抗体の1:2000希釈で翼をインキュベート° C
5日目
- 以下のソリューションを準備します。
- 検出バッファー
- 現像液 - 敏感な光（ホイルでラップ）
- 室温でPBTの3 × 5分間洗浄
- PBTで洗浄7 × 5分
- 検出用バッファー中で翼を2回リンス
- ソリューションの開発の1 mlの翼を開発 - 開発の時間は、それぞれの時間を監視する必要がある - 時間を開発する同じプローブを使用してソリューションを開発する際にも変更できる - 一般的には一晩に間隔を増やしてから5-10分後にチェックして。プレートは、サンプルをチェックしない場合は光の暴露を防止するためにホイルで包まれるべきである。
- 開発停止バッファーで5回リンス
- 翼をマウントします。
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ディスカッション
既存のプロトコルの最適化
（。。らキーズ1999;。ウェザーら1999。キャロルら1994）幼虫の翼ディスクが正常にPRECIS coeniaの蝶からディスクを使用して実行されているのin situハイブリダイゼーション。現在のプロトコルは、幼虫の翼stainingsのためのキャロルの研究室からのリクエストも承ります詳細な書面によるプロトコルから適応されています。我々が行った変更は、幼虫と蛹の翅の組織の違いに対応するために役立つ。蛹hindwing解剖時には、peripodial膜を除去する必要がありますし、井戸に含まれていません。最初の修正の時間は、我々のプロトコルではるかに長いですが、事後修正のステップは削除されました。我々はまだ成功したプローブの浸透を可能にしながらプロティナーゼK溶液の10倍希釈が壊れやすい蛹の翼の組織のために必要であることがわかった。私たちは、一晩4℃で増加信号強度に抗体のインキュベーションを増加させるのに対し、抗体染色の前に翼をブロックして大幅にバックグラウンドを減少させることをもを発見した。
アプリケーション
このプロトコルのアプリケーションは多様です。開発蛹の翼上に候補遺伝子の発現をローカライズするためにで...
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謝辞
私たちは、ジェーンSelegue、マーガレットホリングスワース、ジンベリー、亮Futahashi、NajmusサハルMahfooz、アレクサンダルPopadic、ボブリード、このプロトコルのトラブルシューティングに役立つためにロシュテクニカルサポートに感謝。我々はまた、ムービーの編集上のアドバイスをウィリアムピールに感謝。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| 固定バッファー | PBS含有4% パラホルムアルデヒド | |||
| PBT | PBS含有0.1% Tween 20 | |||
| Proteinase K溶液 | PBT含有2.5mg/ml Proteinase K | |||
| 消化停止バッファー | PBT含有2 mg/ml グリシン | |||
| 前ハイブリダイゼーションバッファー | PHB 50 mlあたり：DEPC処理水 12 ml + ホルムアミド 25 ml + 20 x SSC 12.5 ml + Tween 20 50 ul + 10 mg/ml 鮭精子DNA 500 ul（RNaseフリー、溶液への添加前に熱変性させる）。 | |||
| ハイブリダイゼーションバッファー | 前ハイブリダイゼーションバッファーに1 mg/ml グリコーゲンを添加 | |||
| ブロッキングバッファー | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | 抗体 | Roche Group | 11 093 274 910 | アルカリフォスファターゼ標識 |
| DIG洗浄およびブロッキングバッファーセット | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | 封入剤 |
参考文献
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
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