心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

サマリー

脱細胞組織から注射マトリックスのゲルを調製し、ラット心筋にそれを注入するための方法 in vivoで説明して​​います。

要約

このプロトコルは、心筋組織の工学的応用のための注射細胞外マトリックス（ECM）ゲルの調製のためのメソッドを提供します。簡単に言えば、脱細胞組織は、凍結粉砕、酵素的に消化し、生理的pHにもたらされる。凍結乾燥は、小さなミルで微粉末に粉砕することができる乾燥したECMで、その結果、組織からすべての水分を取り除きます。粉砕後、ECMの粉末を注射マトリックスを形成するために、ペプシンで消化する。 pH7.4に調整した後、液体マトリックス材料は、心筋内に注入することができます。前の特性評価試験の結果は、脱細胞心膜と心筋組織から生成行列のゲルは多様なタンパク質、ペプチドおよびグリコサミノグリカンを含むネイティブなECM成分を、保持することが示されている。組織工学のためのこの物質の使用を考えると、in vivoでの特性評価に特に有用であり、ここ、左心室に壁内注射を行う方法（LV）自由壁がで行列のゲルへのホストの応答を分析する手段として提示され小動物モデル。胸腔へのアクセスは、ダイヤフラムを介して得ていると注射は少しLV自由壁の頂部の上に作られています。生物由来スキャフォールドは、注射の前にビオチン標識によって視覚化し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ニュートラビジンで組織切片を染色し、ジアミノベンジジン（DAB）染色を介して可視化することができます。注入領域の解析も組織学的および免疫組織化学的染色を行うことができます。この方法では、以前に調べた心膜と心筋のマトリックスのゲルは、繊維状、多孔質ネットワークを形成し、注入の領域内の血管形成を促進することが示された。

プロトコル

1。前処理組織の準備

1. このプロトコルを使用する前に、一つは既に選択肢の組織を脱細胞されている必要があります。この例では、新鮮なブタと人間の心膜の試料は脱イオン（DI）水と硫酸ドデシルナトリウム（SDS）に低張と高張リンスを使用して脱細胞されています。
2. 特に、最初の30分間のDI水にブタ心膜を洗浄し、リン酸塩で1％SDS中で継続的にかき混ぜる生理食塩水（PBS）は、5時間超純水リンスに続いて、24時間のためにバッファリング。人間の心膜の場合、最初の一晩DIリンスに続いて、60〜65時間PBSで1％SDS中で連続的に撹拌し、30分間のDI水ですすいでください。彼らの最終的な解決からすべての試料を取り出して、DI水^1を実行^している下に、再度洗い流す。
3. 細胞化を確認するには、OCT凍結培地でそれを凍結新鮮な、小さな部分を削除し、10μmの組織切片の組織学的解析を介して検査用のサンプルに渡って、あらゆる100μmを取る、など、以前に^34-36と報告。
4. 核の不在のための組織を調べるためにヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色を使用してください。一つは、また、H＆Eの結果を検証するためにDNAを蛍光Hoescht 33342染色（1.0μg/ mL）を使用することで、簡単に、、セクションを修正し水分補給をする、水ですすいで、10分間染色し、その後よくすすいで、暗所で保管。別の方法として、サンプルの総DNA含量を定量化するために設計されているキアゲンDNeasy血液と組織キット、などのキットを使用することができます。

2。注射ECMの準備

1. 凍結乾燥
   1. 適切な準備の後、液体窒素でまたは-80℃で保存することによって脱細胞試料を凍結する完全に乾燥するまでサンプルを凍結乾燥。お使いのシステムとあなたのサンプルの水分含量に応じて、これは12〜72時間かかることがあります。
2. フライス加工
   1. 一度完全に乾燥した、ワイリーミニミルは微粉末に乾燥したECMを挽くために使用されます。あなたの目的のために適切なふるいのサイズを選択し、ここに、40ゲージのメッシュが使用されます。サンプルの大部分はフィルターを通して来ていると、粉砕されたECMの粉を使用してコレクションのjarファイルを削除します。唯一の小さなサンプルがある場合は、サンプルの残りの部分は、さまざまな方法で工場から抽出することができます。ここで、Q -ティップは、工場の静翼の後ろにスタックECMを削除するために使用されます。
   2. 常に工場を清潔にし、破片がないことを確認してください。工場とサンプルの両方が完全に乾燥していることを確認することも重要です。残っている水分は、成功した加工を防止する、一緒に集計して塊にECMが発生します。 ECMは、空気中の水分を拾うことができるので、凍結乾燥機から工場に直接行く必要があります。
3. 消化
   1. 注射ECMを形成するために、粉末をペプシンで消化される。次のプロトコルがFreyetes、 ら （2）から変更されました。
   2. それは生体内に注入され、汚染が合併症を引き起こす可能性があるため、可能な限り無菌製品として維持することが重要です。このように、滅菌バイアルを使用し、スプーンの重さと使用前にすべてのソリューションをフィルタリング。ミリング後の消化の前に凍結乾燥のステップはまた、無菌性を維持するのに役立ちます。
   3. 適切なシンチレーションバイアルにECMの粉体の所望の量を秤量。 1 mLの未満の合計ボリュームに対しては、それは、2mLのバイアルを使用するとより大きなボリュームを、20mLのバイアルをお勧めします。これは効果的に攪拌し、バイアルの底部に十分な液体があることを保証します。
   4. シンチレーションバイアルにペプシンの所望量を秤量。ペプシンは1 mg / mLの濃度になるように0.1 M塩酸を追加。これはペプシン溶液をボルテックスで急いですることができます使用する前に、ペプシンが完全に（無微粒子）溶解されていることを確認します。
   5. ECMは、10 mg / mLの濃度になるようにECMの粉でシンチレーションバイアルにペプシン/ HCl溶液を追加。
   6. 定期的に計量スプーンやヘラでバイアルの側面を下にこする、60〜65時間の連続ソリューションをかき混ぜる。
4. pH調整
   1. このステップは、さらにECMを切断しないようにすること、生理的pHに液体マトリックス材料を持参するとペプシンを不活性化するために実行されます。再び、ミリポア水で作られたフィルタリングソリューションを使用してください。
   2. 1 M NaOHを元のボリューム1 / 10に追加されます。この時点でpHをテストし、所望のpH（7.4）に達することNaOHまたはHClを少量（2-10μl）のように追加します。中和のために追加またはpHのテストのために取り外したすべての少量のないことを確認してください。解決策が中和されると、最後のボリューム（1 / 9現在のボリューム）1 / 10に10倍PBSを加える。注射ECMの濃度を決定してから、所望の最終COに到達するための1X PBSを追加するncentration、ここでは6 mg / mLの。
   3. 注射ECMの特性評価は、SDS - PAGE、Blyscan比色GAGアッセイ、および質量分析を介して行うことができます。
   4. この時点では、マトリックス材料は、心筋組織工学のための足場を形成するためにin vivoで注入することができます。
5. ビオチン標識
   1. ECMは、注入されたECMの容易な視覚化のための注射の前にビオチンタグをつけることができます。
   2. ビオチンの10mMの溶液を調製し、0.3mg/mgの割合で注射ECMに追加します。 ECMは、注入用​​の所望の濃度になるようにしてください。に6 mg / mLの濃度で注入した場合、ECMの1mLあたり40μLビオチンを追加。注入前に、少なくとも1時間氷上ビオチン- ECMソリューションを維持する。
6. すべての処理ステップは室温で行うことができます。ゲルから注射行列を保つために、pH調整のステップは、氷上で行われることがあります。

3。心筋注射

1. 注射剤
   1. ここで使用される雌ラット（225〜250グラム）の場合は、pH7.4の注射ECMの75μL注入は30ゲージの針を先端に付いた0.1 mLのシリンジに調製した。雄性ラット（375〜400グラム）が使用された場合、90μLを注入することができます。
   2. すべての外科サプライが術前に滅菌する必要がある、ここではすべての必要なツールが含まれているオートクレーブ外科パックを使用してください。
2. 手術の日に、ハーランのSprague - Dawleyラットに5％イソフルランを使用して麻酔をかけた場合、オトスコープを用いて挿管し、​​プロシージャ全体でイソフルラン2.5％に維持した。
3. 乾燥や髪を保護するために動物の目に人工涙液軟膏を追加。手術中に水分補給のために乳酸リンゲル液3 mLを管理する。これは、下腹部の領域に皮下注射により行われる必要があります。
4. 手足ダウン手術台、ゆっくりとテープ上の仰臥位で動物を置きます。腹部と前のスクラビングに真空無料髪の毛を削除するにはバリカンを使用してください。
5. zyphoidプロセスから腹部の右下に対角線に沿ってリドカイン2％の小さな注射（約50μLずつ）のシリーズを作る。その後、途中で開始し、外側に向かって移動betadineで三回スクラブ。 70％エタノールで繰り返します。既製の丸窓付き外科用ドレープを使って動物をカバーし、必要に応じて、タオルクランプで固定します。
6. 10番メスを使用すると、xyphoidプロセスから腹部の右下に3〜4センチ切開を行います。 xyphoidプロセスを見つけて右に筋肉を通って垂直に下に解剖し、右側の大きな血管に注意しながら。あなたが筋肉を通して解剖したら、横隔膜を露出、筋肉を通して横方向にカットするはさみを使用してください。肝臓を避けるように注意してください。
7. zyphoidプロセスを3から0 Vicrile縫合や止血のペアの36インチ長さ、ドライブ1針を使用し、途中で糸を引く。テープは一緒に縫合糸の両端と本質的にzyphoidを持ち上げ、横隔膜を露出上記と動物の背後にある点にいることを修正。 3から0 Vicrile縫合糸の別の36インチの長さで、xyphoidプロセスに最も近い筋を通して針を駆動し、再び、完全に外科的空洞を公開すること、手​​術台の右側に別の点に端を介してプルと修正。
8. この時点で、横隔膜を通して心臓を見ることができるはずです。ラットの歯のmicroforcepsの小さなペアを使用して、ダイアフラムの中央をつかみ、手前に引き出し、鈍いハサミで非常に小さな切開を行います。それは肺を突っつい避けるために非常に鈍いはさみを使用することが非常に重要です。この穴が行われると、肺は、心臓を視覚化するためにダイヤフラムを通って垂直に2〜3センチメートルの切開を加えることができます、リトラクトされます。
9. 道の肺を押し出すために空洞の左側に3インチ綿棒を挿入します。代わりに、Q -ティップを保護するためにタオルのクランプを使用してください。心膜嚢を見つけるために邪魔にならないよう、右肺に移動する別のQ -ティップを使用してください。 microforcepsのペアと、大きな鋸歯状の鉗子のペアを使用して、心臓の頂点を露出させる、心膜を介して引き裂く。動物は以前に心筋梗塞の手続きを経た場合、心膜はすでに存在しないことになります。
10. ラットの歯のmicroforcepsで心尖を取得し、先端から液体のマトリックス材料の方法の第三を注入する。心外膜面に針を平行に挿入し、左に針の斜めのエッジに注入する。大心臓静脈を避けるようにしてください。針を取り外す前に数秒を待つ。あなたは、注射の部位の組織のホワイトニングが表示されるはずです。
11. 空洞内の血液をクリーンアップし、右肺を持っていたタオルクランプとQ -ティップを削除します。湾曲したmicrohemostatsとラットを使用して、歯は、ダイアフラムを閉じますmicroforceps。最初の結び目を作り、次に連続縫合とテーパー針とダイアフラムを閉じるには、鋸歯状の鉗子とmicrohemostatsを使用してください。完全に閉じる前に、PE160吸引チューブを挿入し、縫合糸が締まっているとして、胸腔を避難させるために10 mLの注射器を使用してください。
12. 適切に避難し、閉じたとき、ダイヤフラムは凹面にする必要があります。凸のダイアフラムはキャビティ内の空気がまだあることを示しています。
13. この時点ではイソフルランは1％までにすることができます。
14. 空洞を開けたまま、両方の3から0 Vicrile縫合糸を取り出してください。 Q - tipや滅菌ガーゼで離れて余分を拭き取り、水和物筋肉に滅菌水を使用してください。断続縫合糸で筋層を閉じるに0-3縫合糸の新しい長さを使用してください。
15. この時点では、イソフルランをオフにすることができます。
16. 滅菌水でエリアを清掃し、皮膚を閉じるには、ステープルを使用してください。ステープルは勉強の妨げになる場合は5-0プロリン縫合糸を使用することもできます。その場合は、断続的な縫合糸で皮膚を閉じるには、リバースカット（RC）針を使用してください。どちらの場合も、閉鎖切開を介して外科的接着剤を見つける。
17. トリプル抗生物質軟膏を使用して切開部位に塗るために、Q -ティップを使用してください。
18. 動物が100％酸素下で回復することができます。
19. 動物が人工呼吸器の周りに呼吸を開始すると、気管チューブを取り外します。
20. 動物が胸骨したら、塩酸ブプレノルフィンの0.05 mg / kgの皮下注射を投与し、滅菌タオルで自分のホームケージに戻す。
21. 動物は、術後の観察とケアを受ける必要があります。
22. 関心の時点で、動物は安楽死され、心は分析のために取り出した。短軸断面積が取られ、総組織分析のためにヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）で染色することができます。短い時間の点で、注入された領域がinterstitially広がっているピンク、繊維状のネットワークとして表示されます。後の時点で、1つが2〜3週間後の細胞の流入と注入行列の最終的な低下を観察します。 ECMは、注入前に、ビオチンで標識されていた場合、それは、HRP標識ストレプトアビジンとビオチンを染色することによって、より直接的に可視化することができる。免疫組織化学的染色は、ここでスライドをAlexafluor二次と内皮細胞と蛍光の緑と抗平滑筋アクチン抗体に結合するFITC結合イソレクチンと共染色されている、注入領域の特定の細胞や構造を識別するために使用することができます。赤色で平滑筋細胞を報告する抗体。

4。代表的な結果

このようにして調製したマトリックス材料の前の特性は、高分子の様々なの保持を示した。特に、複数の繊維状のタンパク質と糖タンパク質は、質量分析法（表1）を介して同定された。このプロトコルに従って処理されたマトリックス材料は、もはや巨大分子の複雑な配列を含んでいないことが判明した場合、それは採用細胞化プロトコルはあまりにも過酷である可能性があります。一度完全に凍結、乾燥された心膜ECMは非常に硬い、紙を丸めてのように見えます。他の組織型はパッキングピーナッツのようになります。よく粉砕した場合、ECMは、ふるいを通して落ちる必要があり、下部にあるjarファイルに収集される。水分サンプルにある残っている場合、ECMは一緒に凝集なりますとフライス加工チャンバーにはまり込む。消化後、ECMソリューションは、乳白色の色と目に見える粒子の完全に自由であるべきです。また、塩酸単独よりもわずかに粘性になります。 ECMがうまく消化されない場合は、まだ瓶の大きな粒子が存在します。代わりに、ECMは、溶液からクラッシュする可能性があります。 pH調整した後、そこに溶液中で目に見える変化がなく、ECMはまだ曇って、均一な液体である。それはゲルに開始された場合、粘度が増加し、それが注射器に材料を策定することは困難または不可能になります。この問題が発生した場合は、あらかじめ冷却ソリューションと、氷の上にpH調整のステップを実行します。注射の準備ができたら、使用するまで氷上で保管して下さい。注入が成功した場合は、針の先端付近の領域は白く、小さな塊が見えるようになります。これが観察されていない場合は、注射は、チャンバーに代わりの壁にあったのかもしれません。注射後、動物を縫合するときに、横隔膜を慎重に閉鎖が最も重要なステップです。正しく行えば、横隔膜、肺に対してタイトになり、凹面が表示されます。肺の内部に残っている空気がある場合、ダイアフラムは凸のまま、またはそれが出バルーンエリアを持つことになります。初期の時点（30分〜4時間後に注射）で注入領域の組織像を調べるとき、人は細胞を欠いているピンクの、繊維状のエリアが表示されるはずです、これは再構築されたマトリックス物質注射後（図2）です。 。ネットワークは、しばしばinterstitially広がり、多くのセクション全体に存在していてもよい。 POSSマトリックスゲルのごく小さな領域を見るためにコンパチブルな説明は、注射の部分が壁内のターゲットを逃したとどちらLVチャンバーに注入または注射の場所から流出したということです。さらに、ゲル化時間に応じて、間質性スプレッドが異なる場合があります。

図1ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）の結果。 （A）分子量標準。 （B）ラットテールコラーゲンタイプI（2.5 mg / mL）を可溶化したヒトの（C）と比較してブタ（D）心膜ECM（7 mg / mLの）。コラーゲンの存在だけでなく、心膜マトリックスサンプルでいくつかの他のタンパク質やペプチドに注意してください。

表1。ECM成分は、質量分析で同定した。

図2心筋注射：in vivoでのゲル化インチ H＆Eは、人間の（A）およびブタの染色（B）45分後に生体内でゲル化している心膜マトリックスの注射。矢印は心筋よりもピンクの軽いステンド、行列の位置を表す。スケールバーは500μmである。

図3。血管細胞浸潤。注入された人間（AC）と二週間でのブタ（DF）マトリックスのゲルで船舶用の蛍光染色。平滑筋細胞は赤（B、E）とラベルされている間、内皮細胞は、緑色（A、D）、ラベルが付いています。マージされた画像は、Cに示されており、Fのスケールバーは100μmであるされています。白い点線は、近隣のセクションのH＆E分析によって決定される行列の注入の面積を、示している。

図4。行列の注入領域内の幹細胞。 Hoeschtは核のために染色（青色）およびc - kit（緑）は（A）ヒトおよびブタ（B）行列の注入領域に幹細胞を識別します。スケールバーは50μmである。

ディスカッション

このメソッドは、心筋組織工学のための生物学的に誘導された、注射足場の世代を可能にする。これらのメソッドが最初に製造するため、心筋マトリックスゲルの in vivo試験で開発され、心膜マトリックスのゲルをここに提示されたが、このプロトコルは、組織が ​​適切に脱細胞することができます提供されて、どんな組織で使用するために適応させることができる。細胞化を行い、マトリックスのゲル中のDNAの存在は望ましくない免疫応答を引き起こす可能性があるので、前のこれらのメソッドの使用に確認する必要があります。そこに材料をdecellularizeするさまざまな方法があり、いくつかの良いレビューが主題^3、4に書かれています。

マトリックスのゲルを調製する際に、それは残りの水分はフライス加工を妨げになるので、サンプルが完全に、凍結乾燥されていることが不可欠です。フライス加工時にも、ECMの粉の吸入を避けるために、常にフェイスマスクを着用する。最後に、マトリックスのゲルは、in vivo試験のために意図されている...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<強力な>試薬：
ペプシン	Sigma-Aldrich	p6887-1G	凍結乾燥された
ビオチン	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidin-HRP	Thomas Scientific	21130
<強力な>器具・装置：
Wiley ミニミル	Thomas Scientific	3383L10
Labconco 凍結乾燥機	Labconco Corp.	7670520
<強力な>手術用備品：
ベタディン	Purdue Products L.P.	67618-154-16
乳酸リンガー液	MWI Veterinary Supply	003966
KYジェリー	MWI Veterinary Supply	28658
リドカイン 2%	MWI Veterinary Supply	17767
塩酸ブプレノルフィン	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
人工涙液軟膏	Fisher Scientific	NC9860843
トリプル抗生物質軟膏	Fisher Scientific	19082795
イソフルラン	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
耳鏡	MWI Veterinary Supply	008699
止栓栓	MWI Veterinary Supply	006245
3-0 Vicryl 縫合糸	MWI Veterinary Supply	J327H
5-0 プロリン縫合糸	MWI Veterinary Supply	s-1173
リバースカッティング（RC）針	Ethicon Inc.	8684G
マイクロ止血鉗子	Fine Science Tools	13013-14
ラット歯用マイクロ鉗子	Fine Science Tools	11084-07
10番メス刃	Fine Science Tools	10110-01
鈍端剪刀	Fine Science Tools	14108-09
鋭利な曲剪（きょくせん）	Fine Science Tools	14085-08
大型鋸歯付き鉗子	Fine Science Tools	1106-12
PE160吸引チューブ	BD Biosciences	427430
クリッパー	MWI Veterinary Supply	21608
皮膚用ステープル/ステープラー	Ethicon Inc.	PRR35
<強力な>一般器具・消耗品：
スターラー
0.1 M HCl
1 M NaOH
10倍PBS
1倍PBS
70%エタノール
0.1 mLシリンジ
10 mLシリンジ
綿棒
外科用接着剤
手術用ドレープ
タオルクランプ
小型手持ち式真空掃除機