このプロトコルでは、我々は、ある軸索の成長にグリア細胞の不均一性の影響を研究する新しい方法を説明 in vitroで共培養系。ラット皮質グリア細胞をコンフルエントに培養し、高度にラットの後根神経節の神経細胞を精製して培養した。神経細胞の接着や軸索の成長上の別のグリア細胞の影響は、同じ文化の中で直接比較した。このメソッドは、直接神経細胞の接着や軸索の成長に対するグリア細胞の不均一性の影響を研究する新しい方法を提供します。
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この記事について
サマリー
要約
すべての哺乳類の中枢神経系では、損傷後の切断軸索が元のターゲットに再生成することができないと機能回復は1非常に悪いです。軸索再生の失敗は、敵対的なグリア細胞の環境を含むいくつかの要因の組み合わせの結果である、抑制性ミエリン関連分子と内因性ニューロン再生の容量2を減少させた。アストロサイトは、中枢神経系で最も優勢なグリア細胞の種類であり、生理学及び病理学の条件3の下軸索の機能に重要な役割を果たす。相同なオリゴデンドロサイトとは対照的に、アストロサイトは、多様な形態と遺伝子発現4別の星状膠細胞亜集団によって構成される不均一な細胞集団である。このような軸索の成長に与える影響として、この不均一性の機能的意義は、、あまり知られていない。
特にグリア細胞、神経細胞の挙動におけるアストロサイト異質の機能を調べるために、我々は、ラットの大脳皮質から得られるグリア細胞と共培養する高精製された後根神経節の神経細胞によって新しい方法を確立した。この技術によって、我々が直接、同一条件で別の星状膠細胞の亜集団のニューロンの接着と軸索の成長を比較することができた。
このレポートでは、我々はこのアストロサイトの単離および培養のための方法、後根神経節ニューロンの単離及び精製、及びアストロサイトとニューロンのDRGの共培養の詳細なプロトコルを与える。この方法はまた、ニューロンとグリア細胞間の細胞または地域の特定の相互作用を研究するために他の脳領域に拡張することができます。
プロトコル
1。グリア細胞培養
グリア細胞は中枢神経系のさまざまな地域から培養することができる。全体のプロセスは、プロセスの図に示します。
1日目コーティング培養プレートとカバースリップ
- オートクレーブで滅菌したガラスの顕微鏡の円形のカバースリップを乾かします。
- 滅菌24ウエル培養プレートにプレート滅菌カバースリップ。
- コートポリ-リジンと根温下で2時間インキュベートするとカバースリップ。
- ステップ3と同じ方法でコート6ウェル培養プレート。
- カバーガラスと蒸留水と文化のフードの乾燥空気と二度6ウェル培養プレートを洗浄してください。
- 24ウェルプレートに各ウェルに200μLのDMEM培地（10％FBS）を追加し、6ウェルプレートの各ウェルに2mLのと、5％CO 2で37度の下インキュベーターに入れてください
皮質とグリ....
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ディスカッション
この実験のプロトコルは、グリア細胞、神経細胞の接着や神経突起の成長に特にアストロサイトの不均質性の影響を検討する2つの目標を達成するために設計されました。最初の目標は、この実験ではアストロサイトの不均一性を可能な限り、維持することでした、コンフルエントグリア細胞培養濃縮星状膠細胞は、さらに細胞を損傷し、アストロサイトの傷害応答を誘発する可能性のある化学的処理と消化の伝播、なしで初代培養を混合した。最後の星状膠細胞純度はfibrobasts FNによって検証として1％未満汚染の線維芽細胞で、90％以上GFAP陽性である。始まる作られた細胞における低播種密度は、合流前に分裂のいくつかのラウンドを受ける。位相差顕微鏡下では、グリア細胞の不均一性は、異なる形態的星状膠細胞によって形成された別の部分構造が観察された。第二の目標は、高精製されたDRGニューロンを取得することでしたし、ニューロンの動作上の不均質性の影響を検討するグリア細胞でそれらを共培養。このような線維芽細胞やシュワン細胞などの後根神経節における混入細胞は明らかにこの不要な影響を避けるために、培養条件5,6の軸索の成長に影響を及ぼすか変えることができる、DRGニ.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この研究はFMMU新しい発見の基盤と部分的にNIHの資金提供によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15培地 | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| ポリリシン | Sigma-Aldrich | P4832 | 培養グレード |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27サプリメント | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| ニューロフィラメント抗体 | Abcam | ab24575 |
参考文献
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A.
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再版と許可
