方法論記事

緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

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DOI：

10.3791/2198

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2010年9月23日

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1National Center for Biodefense and Infectious Diseases, Department of Molecular and Microbiology, George Mason University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

我々はTAT -応答LTR、HIV - 1 TAT -とRev依存的にレポーター遺伝子の発現を調節することができるREV -応答エレメント（RRE）に加えて、所有しているレンチウイルスベクターを開発した。ベクトルは、GFPの発現を介して、生細胞における複製HIVの特異的検出を可能にする。

要約

HIV -応答発現ベクターのほとんどは、HIVのプロモーター、長い末端反復（LTR）に基づいています。初期のHIVタンパク質に応答しながら、タット、LTRはまた、細胞の活性化状態へと統合が行われたローカルクロマチンの活性に応答する。これは、高いHIV -自主的な活動につながることができる、そしてHIV陽性細胞1,2,3をマークするLTRベースのレポーターの有用性が制限されています。ここで、我々は、タット応答LTR、REV -応答エレメントとHIVのスプライシング部位4,5,6を含む多数のHIVのDNA配列に加えて、所有している発現レンチウイルスベクターを構築した。ベクトルは、生きている細胞集団における複製HIVの非常に特異的な検出を可能にして、レンチウイルスレポーターのウイルスに組み込まれた。ベクトルの活動は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を測定した。ここに報告されたとして、このベクトルのアプリケーションは、HIV陽性細胞を識別するために、そのような現場 PCRやHIV抗原染色のような既存の方法、に新たな別のアプローチを提供しています。ベクターはまた、HIV陽性の細胞を標的とする基本的または臨床実験のために治療遺伝子を発現することができる。

プロトコル

1。 REV -依存性のウイルス粒子の生産のためのプラスミドのトランスフェクション

セットアップ：REV -依存GFPレンチウイルスベクター、PNL - GFP - RRE - SAは、以前に4,5,6に記載した。ウイルス粒子にアセンブルするために、プラスミドは、HIV - 1のパッケージ構造、pCMVΔ8.2（親切に先生Dider Tronoで提供される）、およびVSV - Gの糖タンパク質を（pHCMV - G）を有するプラスミドとHEK293 T細胞にcontransfectedした。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法を用いて行った。

バッファーの調製：10 × HBSは、（HEPES緩衝生理食塩水）Hepes緩衝5gを溶解して調製した、8塩化ナトリウムのg、100 mLの中のNa 2 HPO 4（無水）のKCl、ブドウ糖1gの、0.103グラムの0.37グラムH 2 O注しthe10 X HBSの1mLのアリコートにバッファと-20℃で保存トランスフェクションの時に、H 2 O（1:5希釈）で2 X HBSに10 × HBSを変換する、と7.05の間にpHを調整する- 7.12。 （10mLの2 × HBSのために、それは通常1MのNaOHの約50μLが必要です）。 0.22μmのミリポアフィルターを通過することで2X HBSバッファーを滅菌フィルタします。 CaCl 2のバッファは、最終濃度が2Mに10mMのHEPESでCaCl 2を溶解させることにより行われた。 5.8にpHを調整し、4でバッファとストアを滅菌フィルタ℃を

手順：

  1. 100ミリメートルペトリ皿、および37℃で10mLのDMEM + 10％FBSで一晩細胞を成長° C、5％CO 2のトランスフェクションの1日前、シード2 × 10 6 HEK293T細胞。
  2. 翌日、細胞からの上清を除去し、5 mLの新鮮なDMEM + 10％FBS、4時間連続的に培養細胞で置き換えてください。
  3. 5mLのポリスチレンチューブに480μL2X HBSバッファーを添加します。
  4. 目の5 mLのポリスチレンチューブに480μLの合計量を60μL2M CaCl 2のバッファ、プラスミドDNA、およびトランスフェクションTEバッファー（1mMトリス、25mMのEDTA、pH8.0）を加える。各ペトリ皿の場合、プラスミドはPNL - GFP - RRE - SA、pCMVΔR8.37.5μgの、とpHCMV - Gの2.5 mgの10μgの割合で添加する必要があります。
  5. 2 X HBSのチューブにプラスミドDNA - CaCl 2の混合物の滴下を追加し、室温で30分間インキュベートする。微細な析出物が形成されます。
  6. 細胞にピペットで滴下して混合物の960μLを加える。 37℃、一晩5％CO 2を 。
  7. 翌日、上清を除去し、10mLの新鮮なDMEM + 10％FBSを追加し、連続して37℃、5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。
  8. ポストトランスフェクション48時間後に、上清を除去し、50mLの滅菌チューブにそれを転送することにより、ウイルスを収穫。各ペトリ皿に新鮮な10mLの新鮮なDMEM + 10％FBSを追加し、一晩培養し続ける。 4でウイルス上清℃にて保存してください。
  9. 上清を収集することで、72時間後にトランスフェクションで収穫を続ける。すべての上清を組み合わせ、そしてペレットに15分間500 × gで上清を遠心し、細胞の破片を取り除く。
  10. 上清を0.22μmのミリポアフィルターを介して収集し、ろ過した。ウイルスは、さらにサイズ排除カラムを通して濃縮した。

2。ウイルス粒子を集中し、ウイルス力価を決定する

  1. ウイルス粒子は、サイズ排除カラム（100,000 MWカットオフ、Centricoin）により濃縮した。ウイルス上清をカラムにロードされ、4 15分間℃で6000 × gで遠心分離した。
  2. 濃縮されたウイルス上清を回収し、分注し、-80℃で保存した。
  3. ウイルス力価は、TNF -治療、HIV - 1陽性ジャケットの細胞株、J1.1 7の感染によって決定した。細胞を、1ml当たり2.5 × 10 5細胞（100mLの総容積）を96ウェルプレートで培養し、週のための希釈VNL - GFP - RRE - SAの100mLで感染させた。粒子の力価（TCID50）はリードおよびMuench 8の方法に従ってGFP陽性ウェルを計数することにより推定された。

3。レンチウイルスパーティクルとマーキングHIV - 1陽性細胞、VNL - GFP - RRE - SA

セットアップ：ヒトCD4 T細胞株、CEM - SSは、最初のHIV - 1を感染させた。 48時間後の感染では、細胞がレンチウイルス粒子、VN​​L - GFP - RRE - SAとの重複感染した。さらに2日間の重複感染に続いて、GFP陽性細胞はフローサイトメトリーによって分析した。対照として、HIV - 1感染CEM - SS細胞は同じVNL - GFP - RRE - SAに感染させた。唯一のHIV - 1感染CEM - SS細胞はGFP陽性細胞ではなく、HIV - 1感染CEM - SS細胞をもたらした。

手順：

  1. 感染2時間前には、最終濃度4 mg / mlにpolybraneを追加。細胞をカウントし、各感染症のために2 × 10 5細胞を取る。 2時間HIV - 1 NL4 - 3の200 ngの（P24）で細胞を感染させる。
  2. 10分を300 × gで遠心分離により細胞を洗浄、再懸37 2 × 10 5細胞/ mL、そして文化℃、48時間に細胞。
  3. 細胞をカウントし、VNL - GFP - RRE - SAでの感染あたり2 × 10 5細胞を取る。 37℃で一晩VNL - GFP - RRE - SAとインキュベート100 mLを加え。細胞を洗浄し、2 × 10 5細胞/ mLに懸濁します。
  4. 48時間後の重感染でフローサイトメトリー分析を行います。感染細胞をペレット化し、20分間室温でインキュベート500mLの1％paraformaldehede、中に再懸濁し、そしてその後FACスキャンアナライザー（ベクトンディッキンソン）で分析した。

4。代表的な結果

実験が正常に実行されている場合、コントロールに、GFP陽性細胞がHIV - 1感染CEM - SSで検出されず、一方で、かなりのGFPの人口は、フローサイトメーターによるHIV - 1感染CEM - SS細胞で検出されます。細胞。

実験が正常に実行されている場合、REV -依存レンチウイルスベクター、VNL - GFP - RRE - SAは、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現の測定により、細胞集団を生体内で複製HIVの非常に特異的な検出が可能になります。この例では、収穫されたCEM - SS細胞は、マウスCD24、HSAに対するPE標識ラットモノクローナル抗体で染色し、その後、HSAとGFP発現の両方のフローサイトメーターで分析。

図1
図1ここで示したように、かなりのGFPの人口がVNL - GFP - RRE - SA（図1c）との重複感染HIV - 1感染細胞で検出された。対照的に、GFP陽性細胞はいずれのHIV - 1感染CEM - SS細胞にレンチウイルスの重複感染（図1a）またはレンチウイルスの重複感染によるHIV - 1感染細胞（図1b）なしでは検出されなかった。

ディスカッション

以前開発されたTAT -依存性の発現ベクターと同様に、ここで説明するレブシステムは進化HIVプロセスの開発です。 REV -依存性を含めると、複製HIVの存在に大きく依存してLTRベースの発現ベクターをレンダリングします。ここに報告されたとして、このベクトルの応用、HIV -依存性レポーターのウイルスは、HIV陽性細胞を同定するために斬新なアプローチを提供しています。生きた細胞のベクトルの許可検査では、基本的または臨床的実験のための任意の遺伝子を発現し、擬似型付けされたレンチウイルスとして最も細胞の種類や組織へのアクセス権を持つことができる。

開示事項

利害の衝突は宣言されません。

謝辞

作業は、NIAIDからYWの公衆衛生サービス助成金1R01AI081568でとM.ローゼンと2日目（株）主催の2009 NYCDCエイズライドのドナーとライダーの寛大な寄付によって部分的にサポートされていました

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
生物安全キャビネット
37°C 5%CO2 インキュベーター
フローサイトメーターFACSCalibur
遠心分離機Beckman Coulter Inc.Allega®6KR
4°C 冷蔵庫
-20°C 冷蔵庫
-80°C 冷蔵庫
細胞計数器Nexcelom Bioscienceセロメーター® AutoT4
HEK293T細胞株米国国立衛生研究所
CEM-SS細胞株アメリカ国立衛生研究所
Jurkat細胞株J1.1アメリカ国立衛生研究所
DMEM（ダルメクセル・イーグル培地）Invitrogen11965-118
RPMI 1640Invitrogen21870
高濃度FBSInvitrogen10438-018
HIV-1NL4-3クローニングされたプロウイルスDNAを用いてHeLa細胞をトランスフェクションすることで調製した
pNL-GFP-RREpNL4-3のすべてのHIV ORFの完全欠損
pNL-GFP-RRE-SApNL-GFP-RREへのHIV-1 A5およびD4の挿入
pCMVΔ8.2Dider Trono博士による提供
pHCMV-G
10倍 HBS (Hepes緩衝生理食塩水)Invitrogen11344-041
2M CaCl22 緩衝液InvitrogenS-013-154-10
1%パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127
漂白剤
50mlファルコンチューブBD Biosciences358206
5mlラウンド底チューブBD Biosciences352063
0.45μMilliporeフィルターEMD MilliporeSLHA033SS
0.20μM MilliporeフィルターEMD MilliporeSLFG85000
100mmペトリ皿Sigma-AldrichCLS430588
サイズ排除クロマトグラフィーカラム（分画分子量 100,000 MW）Sartorius AGVS2041
2ml凍結保存チューブAxygen ScientificSCT-200
96ウェルプレートBD Biosciences353227
1.7mL マイクロ遠心チューブAxygen ScientificMCT-175-C

参考文献

  1. Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
  2. Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
  3. Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
  4. Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
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  6. Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
  7. Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
  8. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).

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GFP HEK 293T CD4 T

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