多くの感染症は、強力なCTL応答を誘発するが、時折、応答する細胞の量は、病原体の制御に相関しない 1。 CTLの質の1つの尺度は具体的に死滅させる能力です。 2。標的細胞のCFSE標識は、このCTL応答の品質を調査するために使用することができます in vivoで 3,4。
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この記事について
サマリー
要約
カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）を容易かつ迅速に生体内での調査のための関心の細胞集団を標識するために使用することができます。この標識は、古典的な増殖と移動を研究するために使用されています。ここで紹介した方法では、我々は、エピトープの特定のCFSE標識した標的細胞を4-6の生存と殺害を見に養子移入した後にタイムラインを短縮している。その量は、誤解を招く可能性があるとしてCD8 + T細胞クローンの特定の殺害のレベルは、応答の質を示すことができます。特定のCD8 + T細胞はサイトカイン産生と7,8を殺すの低下と時間をかけて機能的に枯渇することができます。また、特定のCD8 + T細胞クローンは、異なるTCRの特異性9と同様に他人を殺すしないことがあります。効果的な細胞性免疫（CMI）の場合、抗原はT細胞の応答の適切な数字だけでなく、機能的に堅牢な応答性T細胞だけを作り出すことを識別する必要があります。ここでは、BALB / cマウスに2つのペプチド特異的T細胞クローンのパーセントの細胞特異的殺傷を評価する。
プロトコル
1。予防接種によってターゲット固有のエフェクターCTLを誘発する（0日）
- ターゲットシステム：開始する前に、特定のエフェクターを決定するとき。 in vivoで CTLアッセイにおける古典のこの例では、我々は特異的CD8 + T細胞を誘発するために精製されたペプチドの予防接種を使用します。ターゲットシステム：同ペプチドは特定のエフェクターを作成し、同系の標的細胞をパルスするために使用されます。また、あなたの特定のエフェクタと目標を得るために全体の病原体やタンパク質を使用することもできます。
- 注射の無菌性を確保するためにバイオセーフティフードの作業面の内側を除染。最初の2 mL試験管に含まれているPBS /マウスに100μLの10％DMSOにペプチドを精製した50μgのを配置することにより、ペプチド免疫を準備します。次に、混合するための1ミリメートルビーズで、最大0.2 mLのマークに非常に冷たい不完全フロイントアジュバントを等量を追加し、。この点から、注入するまで氷上に免疫を保つ。パラフィルムでふたを固定します。
- 速やかに混合後、氷上に戻って乳剤を配置、3分間エマルジョンを混合するために最大のRPMに設定ビーズビーターを使用してください。得られたエマルジョンは、一貫性のマヨネーズのようになります。エマルジョンは、任意の分離が明記されている場合、さらにミキシング、（最大週まで）時間が許せば℃で一晩4℃で座ってすることができます。 ....
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ディスカッション
CFSEは子孫10,11の間で比較的均等に分割するので、このアッセイは、クローン性増殖を含む細胞の増殖能を調査するように変更することができます。また、CFSE標識と組み合わせることができる例の四量体および生物発光13あなたの仮説に応じてより適切な方法をトレースし、他のセルが、、ありますがそれは、細胞遊走6,12を調査するためにラベル付けCFSEを使用することも可能です。
PEも同様に動作しない可能性があります中には、表面マーカーのために共同で染色する場合、それはそう、フローサイトメーター上で複数のチャネルに介してそのCFSEの出血に注意することが重要である、PeCy7は、蛍光団のを選ぶとよいでしょう。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。動物実験は、ウィスコンシン大学マディソン校の動物実験使用委員会（IACUC）によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
謝辞
私は免疫学的アッセイやマウス操作に私を導入するためビアンカMOTHE、カルラOseroff、とマリー=フランスDelGuercioに感謝したいと思います。 GAスプリッタのラボでの作業は、NIHの助成金1 - RO1 - AI - 073558、GLRCE助成1 - U54 - AI - 057153、およびBARD US - 3829から06によって運営されている。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mm ガラスビーズ | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm セルストレイナー | BD Biosciences | 352350 | |
| 96ウェルプレート | Costar | 3799 | |
| Adjulite 不完全フロイント’s アジュバント | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 フローサイトメーター | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes ガラス組織ホモジナイザー | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| 針 | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| パラホルムアルデヒド | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse 溶血試薬 | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| シリンジ | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE キット | Invitrogen | V12883 |
参考文献
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M.
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再版と許可
