開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）</em

サマリー

中間代謝フラックスのガスクロマトグラフィー質量分析による安定同位体のプロファイリングは、線虫で説明されています線虫（Caenorhabditis elegans）。メソッドは、二酸化炭素、有機酸、および開発中の寒天プレート上または液体培養における成人期のどちらかの同位体曝露後のアミノ酸の同位体濃縮を評価するために詳しく説明されています。

要約

安定同位体のプロファイリングが長い遺伝子の突然変異および/または細胞と哺乳動物モデルにおける薬物療法の代謝の結果の敏感な調査を許可しています。ここで、我々は線虫、 線虫（Caenorhabditis elegans）での中間代謝と代謝フラックスの安定同位体のプロファイリングを実行するための詳細な方法について説明します。様々な薬理学的治療にさらされたままの方法は、ラベル付けされた二酸化炭素は、標識有機酸、および若年成人のような線虫の増殖培地の寒天プレートまたは最初にどちらかの初期の開発から安定同位体に暴露された動物で標識されたアミノ酸は、全体のワーム遊離アミノ酸をプロファイリングするために記載されています液体培養インチ遊離アミノ酸は、4％過塩素酸で抽出された全体のワームのアリコートで、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量化されています。普遍的に¹³ C -グルコースまたは1,6のラベル- ¹³ C ₂ -グルコースは、そのラベルの付いた炭素、二酸化炭素の質量分析法（大気および溶存両方）と同様の解糖を介して磁束を示す代謝物がトレースされる安定同位体前駆体として利用されている、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸サイクル。代表的な結果は、同位体の露光時間、様々な細菌の決済プロトコル、および野生型線虫、ならびにとしてミトコンドリア複合体III変異体のワームの同位体の取り込みの相対的な範囲（ISP - 1（qm150）の代替ワームの破砕方法の効果を示すために含まれて）野生型ワームからの相対。生きている線虫における安定同位体プロファイルのアプリケーションは、個々の疾患の遺伝的および/または薬物療法によって引き起こされる全体の動物のレベルのリアルタイム代謝の変化に調査するために新たな能力を提供します。

プロトコル

プロトコルA：C.時の中間代謝の安定同位体のプロファイリングNGMプレート上の虫を開発。

*注意：安定同位体濃縮が正常に同位体の露出（どちらか普遍的に標識した¹³ Cのグルコースまたは1,6付き- ¹³ C ₂ -グルコース）以下の若年成人の線虫の個体数で測定することができる開発の初期段階でまたは成人期初期のいずれかで始まる。このプロトコルは、簡単に液体培地で達成されていない標準的な線虫の増殖培地（NGM）プレート、上動物の健康、発達、そして成長の同時監視を容易にします。

1. 標準的な手法ごとに、線虫の増殖培地10 mLの（NGM）では、100mmのペトリ皿を準備します^。1
2. OP50 E.とNGMプレートを広げる大腸菌 ¹と一晩乾燥させます。
3. プレートに均一に¹³ C ₂グルコース（NGMプレート上に10mMの最終濃度を達成するために） - 200 mMの1,6を500μLを加える。一晩乾燥することができます。
4. 漂白剤妊娠成虫^{1。 13} C ₂グルコース-プレートは、細菌または1,6なしNGMプレート上に卵を回収した。 20℃で一晩。
5. ¹³ C ₂ -グルコースとOP50 E. -翌日、以前に1,6で拡散NGMプレート上に斜線、L1 -逮捕幼虫を転送大腸菌 （上記ステップ＃2、あたり）。若い成人の段階（48〜72時間、菌株によって）にワームを育て、世話のワームを取ることは飢えていません。
6. S.の基礎の3-4 mLのプレートからの同期、初日の若い成虫を集める。
7. 50mLのファルコンチューブにS.の基礎50mLにワームを洗ってください。 5分間の重力によってペレットにワームを許可する。 〜5 mLに上清を取り除く。さらに2回洗浄繰り返します。
8. 3つの100μL分注し^2をカウントすることにより、ワームの数を見積もります。 S.の基底1000ワーム/ mLにワームの濃度を調整します。
9. 1.5 mLのプラスチック遠心チューブにピペットを1 mL（1000ワーム）。
10. 60パーセント4パーセントPCAと内部標準の200マイクロモルの最終濃度になるように内部標準を（ε-アミノカプロン酸）を含むPCAの69μLを加える。
11. ワームは、重力× 5分で解決しましょう​​。別のチューブに上清を除去して保存する。
12. 15秒プラスチックホモジナイザー（Kontesペレット乳棒）と電動ドリル（Kontesペレット乳棒コードレスモーター）を使用してワームのサンプルを挽く。視覚的に光学顕微鏡によるワームの中断を確認する。必要に応じて繰り返します。
13. ステップ＃12からホモジネートと結合するステップ＃11から上清を移す。
14. 5分2250回転（1300 × g）でサンプルを遠心分離します。
15. 新鮮な7 mLのガラス管に上清を移す。以下、ステップ＃20で詳述、タンパク質濃度のアッセイのためにペレットを保存します。
16. pHのサンプル4N KOHを用いて7-8（ニュートラル）レンジへ。
17. 塩を除去するために5分2250回転（1300 × g）で、7 mLのガラス管で中和サンプルを遠心してください。
18. 新鮮な7 mLのガラス管に上清を移す。
19. による代謝物定量のために中和サンプルを準備します。
    1. 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）：HPLCへの直接注射するための中和サンプルの分離50μL。遊離アミノ酸の定量は、以前は次の^3から4に記載のようにHPLC（バリアン）は、o -フタルアルデヒドと蛍光検出をプレカラム誘導体化を使用して実行されます。
    2. ガスクロマトグラフィー/質量分析法（GC / MS）：などのプロトコルD.で詳細を示すように、アミノ酸や有機酸の同位体濃縮のGC / MS測定用イオン交換樹脂（Bio - Rad）を用いて残りの中和サンプルの抽​​出を続行
20. 7 mLのガラス管の中にタンパク質ペレットを（ステップ＃15から）残りのための1N NaOH 1mlを追加します。
21. 溶解するまで回転（Labnet * LabRollerローテータ）一晩しながらインキュベートは室温でタンパク質試料をNaOHで処理した。
22. 標準的な方法（DCプロテインアッセイ、Bio - Rad社）でタンパク質濃度を決定するためにNaOHで処理したタンパク質の75〜100μLを使用してください。

プロトコルB. C.における中間代謝の安定同位体のプロファイリング液体培養での線虫若年成人。

*注：大人線虫の中間代謝フラックスに対する薬理学的効果は、NGMプレート上のいずれか産卵の初日に同位体の露出の始まりを、以下の検討（プロトコル、上記参照）または液体培地にすることができます。我々は、安定同位体と薬理学的エージェントの利用のコスト効率を最大にするために後者のアプローチを好む。

1. 希釈して同期、初日産卵基底S.、500μLあたり2000動物に0.0005％コレステロールを（基礎S.の1Lに1​​％コレステロールの0.5 mLを（95％エタノールに溶解）を追加することによって得られる）を含むの若年成人を。
2. 次のように、25 mL三角フラスコに〜4mLの総量の文化（s）を設定します。

   治療：	NONEを	"DRUG"
   コレステロールとS.基礎	3020μL	3020 UL - "創薬"ボリューム
   安定同位体（1,6 - 13 C 2 -グルコース）	80μL	80μL
   K12 E.大腸菌 （3〜OD 660 2.5）	400μL	400μL
   ヤングアダルトのワーム（2,000）	500μL	500μL
   薬剤A（所望の濃度）	-	必要に応じて

3. 箔でフラスコをカバー。 20℃インキュベーションプラットフォームシェーカーで220rpmで24時間フラスコを振る。
4. 酸素が中間代謝フラックスのために、内因性線虫の代謝物のラベリングを生じるために必要とされるフラスコは、完全に密閉されていないことを確認してください。
5. 50 mLコニカルプラスチックチューブのS.の基底46 mLに4 mLの培養液を添加することによりワームを洗ってください。 5分間の重力によってペレットにワームを許可する。ダウン〜5mLの遺跡に上清真空吸引。 S.の基底で50 mLにさらに2回チューブを補充することで洗浄を繰り返します。
6. 1.5 mLのプラスチック遠心管で1000ワーム/ mLに洗浄したワームを集中する。
7. 最後の200マイクロモル内部標準の濃度は4％PCAを実現するには60％過塩素酸（PCA）および10μMの内部標準（ε-アミノカプロン酸）、2μLの69μLを加える。
8. プロトコルAのあたりのステップ＃11から22のようにサンプルを準備します

PROTOCOL C - 1。大気と溶存二酸化炭素のラベルが付いたカーボンをトレースすることで、プレート上で、成虫で同位体の使用率の監視。

*注：それぞれの開発や、成人の1日の2〜3日以上のワーム内の空き代謝にモニターアイソトープ混入するプロトコルとBの詳細方法、、短い時間の経過とともに同位体の取り込みの成功と動態の総確認のに対し、 （すなわち、数分から数時間）ワームから放出またはワームのエキス内溶存二酸化炭素に含まれる（CO _2）大気中二酸化炭素のモニタリングのラベルによって達成することができます。プレート（PROTOCOL C - 1）上に成長したとき、ライブまたは死菌は、ワームに供給することができます。細菌は、液体培養でワーム（PROTOCOL C - 2）の短期的な同位体の露出は必要ありません。

1. NGM寒天を10 mLでは、100mmのペトリ皿を準備します。ライブまたはUV -殺さOP50 E.のいずれかでNGMプレートを広げる大腸菌 （図1に示した）。プレートは一晩乾燥することができます。
2. OP50スプレッドのNGMプレート（NGMプレート上の10mMの最終的な同位体の濃度用）へのC ₂ -グルコース200mMの1,6 -標識- ¹³を500μLを加える。プレートは一晩乾燥することができます。
3. 同期、初日産卵を取得、NGM寒天プレート上に成長した若い成虫はOP50 Eでのみ広がる大腸菌 。
4. 安定同位体およびE.を含む実験的なNGM寒天プレートに1000若い成虫を転送する大腸菌 （上記のあたりのステップ＃1-2、通りに調製）。
5. 正確な大気のサンプリングと交換できるように、しっかりと密封されて、3方活栓を装着したカスタムガラス室内の場所の実験のNGMプレート（カバーなし）。すぐに光学的に透明なガラスディスクとチャンバーをシール。ガラスディスクを密封するために高真空グリースでプレート上に置く場所縫い目をカバーしています。 "時間0"として記録的な速さ。
6. 30、60、90、120分で20 mLシリンジ3方活栓からガラスチャンバーから大気のサンプルを10mL。事前に準備を10mLのゴム栓に各大気のサンプルを転送すると、真空をシールしている0.1 N NaOH中の1mM NaHCO _3を 1 mLを含有するガラス管を突破した。
7. 20 mLの注射器を用いて、3方活栓を介して各ガラス室にエアバックの10 mLを注入する。大気をサンプリング/ reinjecting後および収集の時点の間のインキュベーションを再開する前にチャンバーへのコックを閉じます。
8. 10mLのゴム栓に栓に20％リン酸100μLを注入するには、大気中のCO ₂のサンプルを含むガラス管を突破した。
9. 大気の2mLを削除し、12mlのブルートップオートサンプラーのチューブ大気中のCO ₂測定用ヘリウムであらかじめ入力に挿入します。
10. ガス比質量分析計（ThermoQuestフィニガンデルタプラス）で"大気中のCO ₂のサンプル"を分析する。
11. すべての大気サンプルの2時間の同位体の潜伏期間とコレクションに続くガラスチャンバーを開きます。
12. S.の基礎3 mLを使用してNGMプレートのワームを洗い流してください。
13. 50mLのファルコンチューブに50 mLのS.の基底にワームを洗ってください。さらに2回洗浄繰り返します。
14. 7 mLの丸底ガラス管（s）で〜1000ワーム/ mLにワームを集中する。
15. ゴム栓と真空シールのガラス管。
16. 100μLを追加20％のリン酸のCO _2を溶解して解放するために注射器でゴム栓を介して。
17. 大気の2mLを削除し、12mlのブルートップオートサンプラーのチューブ溶存CO ₂測定にはヘリウムが事前に満たされた中に注入する。
18. ガス比質量分析計（ThermoQuestフィニガンデルタプラス）で"溶存CO ₂のサンプル"を分析する。

代替プロトコル（C - 2）：大気と溶存二酸化炭素のラベルの付いた炭素をトレースすることにより液体培養における成虫のモニタリング同位体の利用。

1. 同期、初日産卵、OP50 E.で拡散NGM寒天プレート上に成長した若い成虫を入手する大腸菌 。
2. 50mLのファルコンチューブにS.の基底50mLにワームを洗ってください。 5分間の重力によってペレットにワームを許可する。 〜5 mLに上清を取り除く。リピートはさらに2回洗浄する。
3. 1 mLのS.の基底で10 mLの丸底ガラス管に1000若い成虫を転送する。 10mMの最終濃度を達成するためにワームの1mLに普遍的に標識された¹³ C -グルコースの1 Mの株式の10.1μlを添加する。
4. 2分間開いてチューブ内で100％酸素を流れる大気を交換することによって、ワームや同位体を含む酸素を丸底ガラス管。ゴム栓でチューブを直ちに閉じます。
5. 220rpmで20℃インキュベーションプラットフォームシェーカーで実験的なチューブを振る。 "時間0"として記録の開始時間。
6. 30、60、90、120分でゴム栓を通して10 mLシリンジと25ゲージ針を用いて10 mLの丸底ガラス管から大気のサンプル5 mLの。
7. 事前に用意された、ゴム栓に各大気のサンプルを転送するには、密封された真空されている0.1 N NaOH中の1mM NaHCO _3を 1 mLを含む10mLのガラス管を突破した。
8. バック10mLのシリンジと25ゲージの針を使用してゴム栓を介してワームや同位体を含む各実験丸底ガラス管への空気の5 mLを注入する。
9. 収集時間の点の間220rpmで振とうしてワームや同位体を含む実験的な10mLの丸底ガラス管のインキュベーションを再開する。
10. ゴム栓を含む大気中に栓に20％リン酸100μLを注入は、10 mLのガラス管を突破した。
11. 大気の2mLを削除し、12mlのブルートップオートサンプラーのチューブ大気中のCO ₂測定用ヘリウムであらかじめ入力に注入する。
12. ガス比質量分析計（ThermoQuestフィニガンデルタプラス）で"大気中のCO ₂のサンプル"を分析する。
13. 実験期間の終了時に、50mlのファルコンチューブに50 mLのS.の基底にワームを洗う。ワームペレットが重力によって形成することができます。ダウン〜5mLの遺跡に上清真空吸引。 S.の基底の50mLで2回で洗浄を繰り返します。
14. 7 mLの丸底ガラス管で〜1000ワーム/ mLにワームを集中する。ゴム栓や真空シールのチューブを追加。溶存ワームのCO _2を解放するためにゴム栓を介して25ゲージの針を1 mLの注射器を使用して20％リン酸100μLを加える。
15. 2mLの雰囲気を削除し、12mlのブルートップオートサンプラーのチューブ溶存CO ₂測定にはヘリウムが事前に満たされた中に注入する。
16. ガス比質量分析計（ThermoQuestフィニガンデルタプラス）で"溶存CO ₂のサンプル"を分析する。

プロトコルD.処理は、ガスクロマトグラフィー/質量分析法によるアミノ酸と有機酸分析用とBのプロトコルからのサンプルを中和。

1. ビーズの調製：
   1. 1Lビーカーに別々に銀1、銀50ビーズの両方に1 N塩酸を追加。
   2. マグネチックスターラーで30分間、各フラスコを撹拌する。
   3. 洗浄液のpHは、水のpHに等しくなるまで脱イオン水で10回ビーズを洗浄。
2. カラムの準備：
   1. ちょうどパスツールピペット先端の狭い部分の上に綿栓を挿入します。
   2. 列の高さの約3分の1にそれぞれを充填、サンプルごとに2つの列のそれぞれに荷電ビーズを追加。有機酸の抽出にAG1ビーズを使用してください。アミノ酸の抽出にAG50ビーズを使用してください。
3. サンプルの処理：
   1. 充電AG1ビーズとカラムにサンプル500μLを加える。何もサンプルのpHが中性に既にある場合、有機酸を抽出するAG1列に適用する前に（PROTOCOL A、ステップ＃19Bを参照してください）​​サンプルに追加されません。
   2. アミノ酸を抽出するAG50列に適用する前に、残りのサンプルに0.1NのHClを1 mLを追加。
   3. サンプルがカラムを通して完全に実行することができます。
   4. 洗浄液が中性である10倍になるまで水でカラムを洗浄します（7-8のpH範囲）。
   5. 新鮮な、ラベルの付いたガラス4mLのサンプルバイアルにカラムを溶出する。
      1. 有機酸の抽出には、AG1列に3 N HClを3mlのを追加。これは3炭素種（乳酸）、4炭素種（アスパラギン酸、コハク酸、リンゴ酸）、間のラベルの付いた炭素数の合計で同位体濃縮の分析を可能に5炭素種（グルタミン酸）、および6 -炭素種（クエン酸）。
      2. アミノ酸の抽出には：AG50列に4 N NH ₄ OHの3MLを追加。これは3炭素種（アラニン）と5 - 炭素種（グルタミン）の間で標識された炭素数の合計で同位体濃縮の分析を可能にします。
   6. 乾燥するまで一晩アクティ-バップIII蒸発器内のサンプルバイアルを置きます。

質量分析のためのE.サンプルの誘導体化とマシンの設定

各サンプルバイアルにアセトニトリルを50μLとN -メチル- NT -ブチルジメチルシリルトリフルオロアセトアミド（MTBSTFA）の50μLを追加。 、カバー混合し60℃で30分間インキュベートガスクロマトグラフィー/質量分析計（GC / MS）に試料あたり1〜2μLを注入する。

結果のF.分析

1. アミノ酸のピークの定量化。 HPLC分析による各アミノ酸の定量は内部標準のように各ピークの相対面積を使用して計算されます。
2. 同位体濃縮の計算。原子％の過剰、訂正（APE）=（R _SA - R _ST）* 100 / [（R _SA - R _{ST）100]、：}安定同位体濃縮は次式にしたがってそれぞれの種のためにエクセル（マイクロソフト）で計算されますここで、R _SA -サンプルとRの_STの比率-標準の比率。
3. サンプル濃縮の間に統計的な差異を評価。スチューデントt -検定は、相対的なアミノ酸とサンプル間の同位体ラベルの差の有意性を評価するために使用されます。

駐在結果：

安定同位体は、大気中のCO ₂と溶存ワームのCO 2で測定されたラベルが付いた炭素から明らかなように、若い成虫にうまく組み込まれています。ワーム飼育生活のどちらかまたは紫外線照射殺さOP50 E.の大腸菌 ^、13 CO ₂への¹² CO ₂の比率は、リリース大気中のCO _2（図1）からの相対溶解ワームのCO ₂画分に大きかった。餌のワームは、OP50 E.ライブまたは殺害大腸菌は、大幅に（PROTOCOL C1を参照）、洗浄したワームのエキスで測定した¹³ CO ₂から¹² CO ₂比を変化させなかった。

初期の幼虫期から安定同位体への長期暴露は、中間代謝物の同位体濃縮を増加した。ワームが供給されたときに、若い成人、野生型ワームの中間代謝物で決定したというラベルの付いた炭素の訂正原子パーセントの過剰は、すべてのグルタミン酸の種を越えて大きい普遍的に標識した¹³ C -グルコースと同様に処置した動物からの相対開発を通して生菌は、48のラベルが付いた細菌を供給時間のみ産卵大人のステージ（図2）に達した後。

同位体濃縮の回数をクリアする効果。に関係なく露出timecourseの、プレート上に成長したすべての動物は、GC / MS分析のために下流の準備の前に同位体標識の"クリア"された。図2に示すように、クリアリングプロトコルの比較は、2時間細菌なしでNGM寒天平板上での同位体または授乳することなく、ライブ新鮮な細菌で拡散NGM寒天プレート上で2時間ワームを送り、そして、細菌なしでNGM寒天プレート上で餌を含め、行われた2または6時間のどちらか。動物が2または6時間のいずれかの細菌なしでプレート上にクリアされたときに関係なく、同位体の露出のコースの、若い、成人全体のワームの抽出物からの中間代謝物の同位体濃縮に有意差は認められなかった。動物は、その後2時間ラベルのない細菌を食べることによって過剰な同位体の"クリア"されたときにこれとは対照的に、以下の同位体濃縮は、中間代謝物が観察された。しかし、+4、+3で濃縮を増加させ、ワームが早い幼虫期から同位体にさらされたときに5種が明らかになった。したがって、最適な決済プロトコルが収束するNGMプレート上で2時間、その後のインキュベーションにより、安定同位体と細菌で拡散NGMプレート上でのインキュベーション後のワームをクリアすることが決定した。注目すべきは、液体培養で増殖ワームは、S.の基底の三巻で同位体標識と​​細菌（議定書Bを参照）を明確に洗浄し、洗液のGC / MS分析は、サード洗浄で有意な同位体濃縮は認められなかった。

研削ワームは、中間代謝物の最大の濃縮が得られた。 、同様の処理条件は、次の中間代謝物のパーセントの濃縮を最適化するための比較は、単独で超音波処理または超音波処理を加えた研削によって破壊ワームのサンプルで作られた。ワームは、超音波処理によって、次の同位体の露出を中断加えただけの超音波処理により破砕試料よりも大きい同位体濃縮を持っていた研削図3に示すこと。これらのデータは、複数のサブorganismal画分を超音波処理によるよりも研削することにより破壊されたことを示唆している。その後の研究では、sonicatioなしで単独で研削を明らかにしたnは、最大の同位体濃縮を（データは示さず）を達成するの​​に十分であった。

全体ワーム同位体の露出は、中間代謝経路のフラックスの解析を可能にします。開発中にどちらかの安定同位体で生きているワームフィーディング（PROTOCOL A、図4A）または開始成虫期の動物で（プロトコルB、​​図4B）解糖系を介して磁束を示す代謝物の間で同位体濃縮の感度分析を可能にする（乳酸、アラニン）、ピルビン酸代謝（アラニン）、およびトリカルボン酸サイクル（クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン）。普遍的に標識した¹³ C -グルコースの1,6の利用に対し、すべての炭素種の堅牢なラベルを提供- ¹³ C ₂ -グルコースは、各代謝物の1種で、堅牢なラベリングが可能になります。この手法は、敏感にそのような複雑なIIIミトコンドリア呼吸鎖サブユニット変異体ISP - 1とミトコンドリア呼吸鎖変異株、（qm150）の間で、野生型ワームの仲介代謝フラックスとの違いを見分けることができます。 ¹³ K12 E.と液体培養におけるC ₂ -グルコース-図5は、ISP - 1（qm150）とN2のワーム1,6に24時間暴露それぞれの間に絶対的なラベルで観察された差の大きさを示しています。産卵の若い大人のステージ（プロトコルB）の初日から大腸菌 。ミトコンドリアの変異体ワームの範囲内で追加の安定同位体の研究が進行中である。

図1。普遍的に標識した¹³ C -グルコース安定同位体は、若い成虫にうまく組み込まれた ¹³ CO _^2：12に供給する2つ時間以下の野生型（N2）ワーム普遍的にCO ₂の比率（原子パーセントの超過（APE）、訂正） ¹³ C -グルコース標識され、どちらUV殺菌またはプレート（PROTOCOL C1）でOP50細菌を生きる。ワームの代謝物への¹³ Cの取り込みは、同位体の暴露の2時間後に堅調に推移しました。青と赤のバーはそれぞれ気相中での相対的な同位体濃縮（"大気中のCO _2"）と液相を（"ワームのCO _2"）、を示している。

図2。長時間の同位体の初期の幼虫期間から露出し、続いて細菌なしNGM寒天プレート上で"クリア"ワームは、若い成虫の自由なグルタミン酸の同位体濃縮を増加した。普遍的に標識したグルタミン酸種の同位体濃縮がNGM寒天プレート上に供給されるワームのために示されている^13のどちら959細胞若い成人の段階を通じて、L1幼虫期から開発全体のC -グルコースとOP50バクテリア（"L1"、プロトコルを参照してください）、または四十八時間のためにワームは、産卵若者の最初の日に達したときに開始大人のステージ（"YA"）。 X軸は、それぞれのグルタミン酸の種で標識された炭素原子の総数を示します。 Y軸はパーセントの濃縮を（過剰あたり訂正原子（APE））を示しています。緑色のバーは、OP50 E.を供給することによって、次の同位体の露出をクリアワームを示す前にPCAの抽出に2時間NGMプレート上の同位体のない大腸菌 。青と​​グレーのバーは、ワームは、前のPCA抽出するために、それぞれ2または6時間の細菌や同位体なしNGMプレート上に以下の同位体の露出をクリア示している。

図3。収量の中間ワームの代謝物の最大の同位体濃縮を粉砕することによりワームを混乱させる 。 1,6と液体培地で24時間の治療を受けた野生型ワームで1クエン酸の種で測定された炭素の濃縮のパーセント- ¹³ C ₂ -グルコース細菌（プロトコルB）なし。黒とグレーのバーはそれぞれ、超音波処理のみによって、または超音波処理により破砕し、粉砕されたワームを示している。 1,6への暴露後に同位体濃縮- ¹³ C ₂ -グルコースは、最高の一つの炭素で標識された代謝物で評価される。普遍的に標識- ¹³ C -グルコースが利用される時とは対照的に、ラベルは、各代謝物のすべての種に富んでいる。

図4。代表的な結果は、解糖、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸サイクルを通じて、フラックスの指標とワームの中間代謝物の同位体濃縮の程度を示しています。修正原子パーセントの超過（APE）が1以下の若年成人の野生型（N2ブリストル）ワームで決定された、 6から¹³のプレート上にL1段階から開発中のC ₂ -グルコース曝露のどちらか（）（プロトコルA）、または液体培地で24時間若年成人（プロトコルB）のような産卵の最初の日（B）開始。エラーバーは3つの生物学からの信頼性同位体のデータが提供されていた複製の標準偏差を示している。

図5。野生型およびミトコンドリア変異型ワームの株のアミノ酸代謝物の種の絶対的なアミノ酸の定量 。 4個のアミノ酸のそれぞれの種の絶対的なラベルは、それぞれの種のための修正された原子パーセントの超過（APE）でHPLCによって決定される遊離アミノ酸濃度（nmolの/ mgのワームのタンパク質）を乗じて算出した。灰色と黒のバーはそれぞれ、（ISP - 1（qm150））野生型（N2ブリストル）とミトコンドリア複合体IIIのサブユニット変異株を示す。バーは、株あたり3つの生物学の反復実験の平均を示している。

ディスカッション

中間代謝物の同位体存在度を測定する質量分析法を適用すると、重要な生化学的変化⁵の素晴らしく詳細な画像が得られる。ここで、我々は遺伝的に汎用性の高いモデル動物、Cで中間代謝フラックスを評価するために、この高感度および特定の方法論を活用するための詳細なプロトコルを提供しているエレガンス 。下流の代謝物の同位体濃縮を測定する際に実際に、安定同位体標識された代謝前駆体（例えば^、13 C -グルコースのような）で生きている動物を餌と中間代謝経路のフラックスに新たな洞察を可能にします。我々は、解糖、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸サイクルを通じてフラックスの堅牢な分析を得るために信頼性の高い方法論を開発した。これは、初期の幼虫の発育段階から安定同位体を与えられた動物や有糸分裂後の成人期に始まる両方達成することができます。以前に無料のワームのアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびグルタミンの異なる種の絶対的な同位体濃縮を決定するために^、4を説明するように別の代謝産物の種の同位体濃縮は、高速液体クロマトグラフィーにより全体ワーム遊離アミノ酸のプロファイリングと一緒に勉強することができます。 1,000〜2,000若い成人同期ワームのアリコートでアミノ酸と有機酸の分析物を測定する際に実際に、同位体濃縮の一貫したパ​​ターンが得られる。そのような方法論は、敏感に、野生型ワームへの相対核遺伝子ベースのミトコンドリア変異株では異常な中間フラックスを区別することができます。

このテクニックは、代謝の一般的な先天との関連性の特定の生化学的経路に磁束の変化を調査するために値を保持します。特に、安定同位体で標識されたグルコースの利用率は、ミトコンドリア病との関連性の中心的な代謝経路を介して炭素フラックスを通知します。確かに、私たちのデータではそのような方法論の適用は、敏感に、野生型ワームへの相対核遺伝子ベースのミトコンドリア複合体IIIのサブユニット変異株（ISP - 1（qm150））における異常な中間フラックスを識別することができます示唆している。

同位体の暴露が数日に一つの期間に完了するので、細胞ベースのモデルで決定される可能性があるので、定量同位体濃縮が定義された期間にわたって、"定常状態"濃縮値ではなく、定量化可能なフラックスを表していることを認識することが重要です。数分から数時間の間、同位体にさらされる。線虫の開発の過程で経路のフラックスを問い合わせるの別の潜在的な制限は、特定の変異株で発生する幼虫の発育の長さが異なるにも関する。例えば、多くの重篤なミトコンドリアの変異は、サード（L3）幼虫のステージ⁶で停止を引き起こすことが知られている。従って、唯一の成人期まで生存する動物の同位体の取り込みの分析は、全​​体の変異体集団を代表できない場合があります。しかし、この方法論は、特定の幼生期（例えばL2など）ではなく、動物が成体段階に到達するのを待つで中間代謝物の同位体の取り込みを評価するために適合させることができる。同様に、dauerとして知られている別の幼虫期に入る動物はおそらく大幅にfour幼生段階を経て直接進む動物に（可能性低い）代謝フラックスの相対的に変更している。今後の研究はまた、直接の異なる遺伝的背景のdauer段階の動物の同位体の取り込みを評価するために行うことができた。動物は若い成人の段階に達すると開始一定時間（ここで、24〜48時間）のための安定同位体に動物を公開すること（のようなプロトコールBで詳述）変数発達期間の影響を除去。 ¹³ C -グルコースのみが解糖、ピルビン酸代謝およびトリカルボン酸サイクルのフラックスに問い合わせをしながら、他の同位体トレーサーは、潜在的に線虫への関心の他の経路を介して生化学的経路のフラックスを調べるために評価することができます。例えば^、15 N -グリシンは、線虫におけるアミノ酸の代謝回転を評価するために利用される場合があります。

このアプローチのもう一つの潜在的な制限は、代謝物の検出感度のレベルです。我々の経験は500​​若い成人の線虫の最小が正常にここで採用さHPLCとGC / MS法によって同位体の取り込みを定量化するために必要な示唆している。我々はこれが単一のワームから代謝物の種に代謝物と同位体の取り込みの信頼性の高い定量を許可する可能性は低い予想がこのような超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）のような高感度、と手段の利用、研究動物の数のさらなる削減を許可することがあります。我々は確実にそれぞれの菌株で低濃度の代謝物を検出するために見つけたの実験あたり1,000の動物のワームの集団を、研究。しかし、そのようなGABAのようないくつかの代謝物が、、唯一の確実のために、線虫のより大きな集団で定量することができる1 × 10 ⁶匹^4。

要約すると、安定同位体のプロファイリングは、長い先天性代謝異常を研究するために利用されている非侵襲的で安全な（非放射性）アプローチを提供します。 C.にこの方法論の適用線虫は、個々の遺伝性疾患および/ ​​または薬理学的エージェントの暴露に起因する生体 、全体の動物のレベルで発生するリアルタイム、代謝の変化、 で調査するために新たな能力を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
S. basal		1 - 59ページ	プロトコル A および B
コレステロール	Sigma-Aldrich	C-8503	プロトコル B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		プロトコル A および C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		プロトコル B
NGMアガー	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	プロトコル A、B、および C
13C グルコース（全標識）	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	プロトコル A および C
13C グルコース（1,6位標識）	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	プロトコル B
60% 過塩素酸 (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	プロトコル A および B
ε-アミノカプロン酸（内部標準）	Sigma-Aldrich	A-2504	プロトコル A および B
MTBSTFA	Regis	270243	プロトコル E
アセトニトリル	Regis	270010	プロトコル E
AG 1-X8, 100-200, 塩化物形樹脂	Bio-Rad	140-1441	プロトコル A および B（有機酸抽出）
AG 50W-X8, 100-200, 水素形樹脂	Bio-Rad	142-1441	プロトコル A および B（アミノ酸抽出）
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	プロトコル C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	プロトコル C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	プロトコル D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	プロトコル A
0.1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	プロトコル D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	プロトコル D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	プロトコル A および B
脱イオン水	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	プロトコル D
ヘリウム	Airgas	24001364	プロトコル C2
SMZ-800 ズーム実体顕微鏡	Nikon Instruments	NI MNA41000	プロトコル A、B、および C
pHメーター	Fisher Scientific	S68167	プロトコル A および B
卓上遠心機 - 5804R	Eppendorf	05-400-93	プロトコル A および B
インキュベートプラットフォームシェーカー	New Brunswick Scientific	M1324-0004	プロトコル B
Mini LabRoller ローテーター	Labnet International	H-5500	プロトコル A および B
ペッスル	Kontes Corp	K749520-0090	プロトコル A および B
ドリル	Kontes Corp	K749540-0000	プロトコル A および B
1 L ガラスビーカー	Fisher Scientific	02-539P
1 L 三角フラスコ	VWR international	89000-368
25 mL 三角フラスコ	VWR international	89000-356	プロトコル B
7ml 丸底ガラスチューブ + ゴム栓	VWR international	VT6431	プロトコル A、B、および C1, C2
10 ml 丸底ガラスチューブ + ゴム栓	VWR international	VT6430	プロトコル C2
ブルーキャップチューブ	Labco	438B
50 ml 円錐形プラスチックチューブ	Falcon BD	14-959-49A	すべてのプロトコル
1.5 ml マイクロチューブ	Fisher Scientific	02-681-320	プロトコル A および B
シリンジ（1 mL, 10 mL, 20 mL）	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	プロトコル C1 および C2
25ゲージ針	Fisher Scientific	22-253-131	プロトコル C1 および C2
Poly-Prep クロマトグラフィーカラム	Bio-Rad	731-1550	プロトコル D
パステゥールピペット	VWR international	14673-043	プロトコル D
60mm ペトリ皿	VWR international	25373-085	プロトコル C
ガラスチャンバー（1 L フラスコの底をカットしたもの）、グリスシール3方コック付き	特注品		プロトコル C
光学的に透明なガラスプレート	特注品		プロトコル C
Reacti-Vap III エバポレーター	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	プロトコル D
綿	VWR international	14224-516	プロトコル D
高真空グリス	Dow Corning	1597418	プロトコル C1
アルミホイル	Fisher Scientific	01-213-18	プロトコル B
タイマー	ISC Bioexpress	T-2504-5	プロトコル C
ガス比質量分析計	Thermo Fisher Scientific, Inc.		プロトコル D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	プロトコル D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	プロトコル D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	プロトコル D