コロンは（CASP）腹膜炎ステントAscendens - 複数菌腹部敗血症のための標準モデルを

サマリー

コロンはステント性腹膜炎Ascendens（CASP）げっ歯類における複数菌腹部敗血症のための高度に標準化されたモデルです。この記事では、CASPの外科的手順を説明します。 CASPのモデルおよびその変種は、敗血症の主題に関わる様々な問題の体系的調査を可能にする。

要約

敗血症は、世界中の集中治療室での永続的な問題として残っている。敗血症の複雑なメカニズムを理解することは、この分野で新しい治療法を確立するための前提条件となります。従って、動物モデルは、密接に人間の病気を模倣しても十分に科学的な質問に対処することができることが必要です。コロンはステント性腹膜炎Ascendens（CASP）げっ歯類における複数菌腹部敗血症のための高度に標準化されたモデルです。このモデルでは、小型のステ​​ントは、外科的に腹腔内に腸内細菌の連続的な漏洩につながるマウスやラットの上行結腸に挿入されます。手続きの腸内細菌による腹膜炎、全身菌血症、臓器の感染症の結果、およびいくつかの炎症と抗炎症性サイトカインの全身だけでなく、ローカルのリリース。 CASPの致死率は、挿入されたステントの直径によって制御することができます。このモデルの変形、介入（スピー）を持つ、いわゆるCASPは、臨床実践における一般的な手順に従って、再手術による感染病巣を除去する機会を発生させます。 CASPは、密接に腹部敗血症の臨床経過を模倣容易に学習可能な、再現性の高いモデルです。それは、免疫学、感染症学、または手術など、いくつかの科学分野での質問で勉強する方法をリードしています。

プロトコル

1。マウスの準備

1. 麻薬液の腹腔内注射によってマウスを麻酔（試薬の表を参照）と仰臥位に入れてください。
2. マウスの足は運転中に動物の安定した位置を確保するためにプレートにテープで固定する必要があります。

2。動作

1. 一般的にヒトに静脈内注射に使用されるIVカニューレを、取る、そしてその先端からプラスチック製のチューブ循環2mmを彫る。我々は、死亡率（; 16GA（1,7 x45mm、180 mL /分）14GA（2,0 x45mm、270 mL /分）BD Venflon 18GA（1,2 x45mm、80 mL /分））を制御するためのカニューレの3種類のサイズを使用。
2. 腹部の皮膚を徹底的に消毒した後、15ミリ程度の正中線に沿って切開する。白線に沿って腹部の筋肉と腹膜を切開による腹膜の洞窟を開きます。
3. 盲腸ポールを特定し、慎重に盲腸、回腸末端と綿棒を使用することによって腹部から上行結腸を引き出します。
4. 回盲弁から15mm遠位、一つは穴を開けるために7 / 0縫合糸と上行結腸の壁を持っています。これにより、腸の血管の病変は回避する必要があります。縫合糸は、2つの手術ノットで大腸壁に固定されています。
5. 今穿刺7 / 0縫合糸から近準備カニューレ1〜2ミリメートルと上行結腸。プラスチックチューブの溝が漿膜とレベルになるまで慎重にコロンにカニューレを挿入する。
6. カニューレの周囲7 / 0縫合糸の自由端を入れ、正確にプラスチック製のチューブの準備畝に2倍の結び目を置きます。
7. 今、それはコロンのantimesenteric壁を通って7 / 0縫合糸とステッチの針を取る。連続して、2つの手術の結び目は、さらに、大腸壁にプラスチックチューブを固定するために実行する必要があります。縫合糸の端をカット。
8. カニューレはほとんどの鉄の一部を取得し、固定7 / 0縫合糸にプラスチック製のチューブに近いオフ（1ミリメートル）をカット。
9. 今一便の小さな先端はステントの上部に表示されるまで慎重に綿棒を使用することにより、大腸ステントに向かって盲腸から便を牛乳に持っています。
10. 生理食塩水0.5 mLを腹腔内投与による腹膜洞窟とperforme流体の蘇生に腸を戻す。
11. 連続縫合（4 / 0）と腹膜を閉じます。
12. 特異縫合（4 / 0）で皮膚を閉じます。

3。術後処置

1. 十分な食料と水を含んでいるはずのケージに動物の背部を、置く。鎮痛のために、強力な鎮痛物質（我々はブプレノルフィンを使用）の腹腔内投与は定期的に実行する必要があります。
2. 操作後の最初の2日以内に、人は動物を6時間ごとに制御する必要があります。

4。シャムCASP

1. ステップ1.1から2.4までを実行します。
2. 穿刺コロンをしないでください。徒歩での2.6から2.8を実行してください。
3. 手順2.10から3.2までを実行します。

5。スピー

1. CASPは14Gカニューレの以下の手順で1.1から3.1を使用して実行
2. CASP後の5時間は、1つは、再び動物を操作する必要があります。ステップ1.1から1.2にしたがって、再度マウスを準備し、麻酔
3. 腹壁の縫合糸を開きます。
4. 挿入されたステントで上行結腸を引き出します。
5. 慎重にステントを固定する縫合糸をカットし、ステントを削除します。
6. 単一の反転縫合（7 / 0）とコロンの欠陥を閉じます。
7. 腹腔内に戻って腸を入れ、生理食塩水10mLで2回、後者をフラッシュする。
8. 連続縫合（4 / 0）と腹膜を閉じます。
9. 特異縫合（4 / 0）で皮膚を閉じます。
10. ステップ3.1から3.2に従ってください

6。代表的な結果

操作の後数時間以内に、動物は最初の敗血症の臨床症状を示しています。病気の典型的な症状は発汗、モビリティ、剛毛で覆われたコートを削減している、食物摂取、体重の損失とも減少休暇の動作を減少させた。連続して全身感染症を伴う重症腹膜炎を開発する動物は、通常48時間以内に死亡する。挿入されたステントのサイズに応じて、個別の死亡率を生成することができます。 100％の死亡率で14Gステント結果、16Gは、70％の死亡率を与え、50％の死亡率は、18Gステント（図1a）を使用してアクセスすることができます。 100％の生存率におけるシャムの操作の結果。通常、すべての動物は、CASP後の最初の48時間わたってるしき死ぬ。従って、この時点で生きているすべての動物は生存者とみなすことができる。しかし、我々は稀な"遅い死"CASP後を検出するために少なくとも72時間の追加の観察期間をお勧めします。

スピーの結果は、ステントが削除されたCASP後の期間に依存します。 45％の生存率のCASP結果の後に介入3H。ステントは、CASP、10％だけ後5hに削除される場合動物は、手順を生き残る。 100％（図1b）の死亡率の9H結果の後にステント除去。シャムスピーは100％の生存率につながる。通常後でCASP後48時間以上死ぬ動物が、あるため、スピーの設定については、私たちは10日間の観察期間をお勧めします。

浮腫、血管拡張、erythematic腸壁、パイエル板の鋭い境界、腸管麻痺、無料の流体、および敗血症性分泌（図2）：24時間CASP後の腹部内臓の肉眼検査では、腹膜炎の典型的な兆候を示しています。

全身感染症は、細菌学的分析によって示すことができる。 12時間CASP後、大規模な細菌の量が腹腔洗浄液中で検出することができる、血液、肝臓、肺、脾臓、および腎臓。細菌の定性分析は、E.のような典型的な腸内細菌による全身感染症を明らかに大腸菌 、バクテロイデス属、腸球菌種、など（図3）。

CASP誘発性敗血症は、プロと抗炎症性サイトカインやケモカインの地元とも全身のリリースで現れます。 TNF、IL -1β、IL - 6、IL - 10、MCP - 1などのCASP、かなりの量の後12時間はならず、臓器の懸濁液、例えば肝臓、肺、脾臓、腎臓の上清中に血液中のELISA法により測定することができます。 （図4）。

あなたの実験室でCASPを確立するときに、生存率、細菌およびサイトカインの放出は、CASPの適切なパフォーマンスを得るための制御パラメータとして解釈されるべきである。標準はすべての実験の設定に対して、システムを読み出すように後で、これらのパラメータを取得することもできます。

図1a：CASP後の生存 。 CASPの手術後の生存率は、挿入ステントの直径に依存する。死亡率の100％の割合、70％の死亡率で16G CASPの結果、および18G CASPで14G CASPの結果は、50％の死亡率につながる。シャムCASPは100％の生存率に関連付けられています。 。N = 20/group B：生存率スピー手術後のステントの除去の時間に依存する。 14G CASP後の3Hでのステントの除去は55％の死亡率につながる。 100％の死亡率で14G CASPの結果の後に9Hでのステントの除去に対し、90％の死亡率で14G CASPの結果の後5時間でのステントの除去。シャムスピー（5H）100％の生存率の結果。 N = 10/group（シャムスピー、スピー9H）、N = 20/group（3Hスピー、スピー5H）。

図2：CASP後の腹部内臓の24時間 。腹壁はそれぞれ、16​​G CASPまたは偽CASP後24削除されました。偽手術のマウスの内臓は生理的に見えます。対照的に、浮腫、充血、dilatated腸、およびパイエル板の分界のCASPの結果は、重度の腹膜炎を実証。

図3：細菌学 。 CASPは、手術後12時間以内に腸内細菌によって、いくつかのコンパートメントや臓器の重篤な感染症につながる。細菌数はコロニー形成単位（cfu）1mLあたり、それぞれとして与えられる。偽手術したマウスから採取した細菌培養（図示せず）が完全に無菌である。 16G CASPは、n = 5/group。

図4：サイトカイン 。いくつかのサイトカインやケモカインは、臓器の上清においても血漿中で検出可能であるととしてCASPは、全身免疫応答をトリガします。図は、例示的に炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子（TNF）とインターロイキン-6（IL - 6）だけでなく、主に抗炎症IL - 10を示しています。 CASP後の12Hは、注目に値するレベルは血漿、肝臓、肺、および脾臓で検出することができます。しかし、IL - 10は、CASP後の肺と脾臓で検出することはできません。偽手術は、どのサイトカインの分泌（図示せず）につながるものではない。 16G CASPは、n = 5/group。

ディスカッション

、CASPは小動物で行うことができます簡単に標準のパラメータにより監視するために、高い再現性であり、優れた機能が実現可能であることを読み出す提供、そして密接にの臨床場面を模倣している：CASPは、貴重な敗血症モデルに対して想定されるほとんどの基準を満たしている腹部の敗血症の複数菌モデルです。腹部敗血症。比較研究では、盲腸結紮穿刺（CLP）がで腹腔内膿瘍形成のモデルを明らかにする一方、CASPは、早期かつ着実に増加して全身感染症や炎症（全身性炎症反応症候群）とびまん性腹膜炎につながることを示している可能性が持続し、マイナー全身性炎症の徴候（1）。スピーの技術は、ヒトにおいて最も重要な治療原則である連続した外科フォーカス衛生、と腹膜炎の臨床経過をシミュレートする可能性を提示。 CASPは、CASPのモデルを使用して敗血症の異なる主題に関する出版物の選定免疫学、薬理学、外科、集中治療医学、等例えば、敗血症や腹膜炎の周りすべての質問に対して適用され、したがって、敗血症の研究を扱うすべての分野に有用であることができる（1-14）を以下に示します。

CASPで始まるとき、人はいくつかの練習が正確にかつ迅速に操作を実行するために必要であることを認識する必要があります。手術の経験が役に立つかもしれませんが、必須ではありません。我々は、CASPの適切なパフォーマンスのためのパラメータとしてletalityの検出をお勧めします。大規模なステントは、薄いものより扱いやすいように一つは14G CASPで始まる必要があります。訓練されたCASPの外科医は10分以内つのマウスを操作することができます。どんな実験を開始する前に、あなたがその期間に近いことを確認する必要があります。あなたが手術といくつかの経験を得たとき、あなたはあなたのスキルをチェックするために生存運動を実施する必要があります。 14G CASPは、100％の致死性になるはずです。我々の研究室での初心者は、彼らが実験を開始する前に14G CASPと100％の致死率を生成することができることを証明する必要があります。また、細菌学およびサイトカインの測定は、敗血症を確認するために実行する必要があります。あなたがCASPの顕微ステップと始まりの問題がある場合は、拡大鏡や手術用顕微鏡の使用が役立ちます。しかし主に、CASPは、よくこれらのユーティリティなしで行うことができます。私たちの生存率の再現のために、それは同じ材料、特にステント（BD Venflon、下記参照）が、使用されることは絶対に必要です。そうでなければ、結果のかなりのバリエーションが可能です。さらに、我々は、例えば、上の外科医の個性に応じて結果の違いがあることを示唆している。しかし、そのような要因の影響は小さいはずです。

要約では、CASPは密接に腹部敗血症の臨床的状況を模倣する実用的な、シンプルで、再現性と貴重な敗血症モデルです。したがって、敗血症の研究のすべてのフィールドに適しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔液			Rompun 0.5 mLをKetanest 4.0 mLと混合し、生理食塩水 (0.9%) 5.5 mLを加える。完全麻酔のため、体重 10 μL/g を腹腔内に投与する
Rompun (20 mg/ml Xylazine)	Bayer AG
Ketanest (25mg/ml Esketamine)	Pfizer Pharma GmbH	647028001E
BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min)	BD Biosciences	391457
BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min)	BD Biosciences	391455
BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min)	BD Biosciences	391456
キャットガット ポリエステル 4/0 ホワイト、非吸収性	Catgut GmbH	17218113
Mariderm ブラック 7/0、非吸収性	Catgut GmbH	18104900