末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

パート1：スライスと培養のための準備。

1. 培地（DMEM、25％1X HBSS、25％ウシ胎児血清、0.5％グルコース、1mMのグルタミン、2.5mMのHEPES、pH7.3）に、3 cmのMillicell - CM 0.4 -μmの文化をスライスして10cmの組織培養プレートを準備します。膜インサートと37℃のインキュベーター内で維持℃、5％CO _2。
2. それは約37にとどまるように電子レンジでPBS中4％低融点アガロースを加熱し、加熱板上でそれを維持℃に
3. PBS（140mMのNaCl、2.7 mMのKCl、10mMののNa ₂ HPO _4、1.8mmのKH ₂ PO _4）と氷上の場所で10cmの細菌シャーレを埋める。
4. ミクロトームの冷却装置を設定するか、そのバッファのトレイと冷却要素がそれより前のクールに冷凍庫に保存されていることを確認してください。

パート2：胚の埋め込み。

1. 子宮から胚を摘出し、GFPの発現を確認するために倒立蛍光顕微鏡でそれらを調べる。
2. 過度のPBSを除去するワットマン濾紙片を使用して反転10センチのシャーレと向き、それらの上に置いて胚。
3. この位置でそれを修正するために胚のアガロースを適用します。アガロースが固化してみましょう。
4. かみそりの刃で切断して胚を囲む領域を制限する。
5. その反対側に埋め込まれた胚を回転させる。
6. 胚が完全に埋め込まれていることを保証するために胚組織に追加のアガロースを適用します。
7. クリーンなエッジを持つアガロースブ​​ロックを準備し、ロックタイト406"クレイジー接着剤"に似た特殊な接着剤を使用してビブラトームチャック上にマウント。

パート3：手順をスライス。

1. あらかじめ冷却したバッファートレイと冷却要素を設定します。
2. 接着組織でチャックを挿入し、カバーまで、1X HBSSを（ ^{のCa 2 +}とMg ^{2 +}フリーHBSS、10mMのHEPES緩衝液、pH7.3、500 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン）を追加。
3. precleaned（70％エタノール）ミクロトームの刃を挿入し、固定する。
4. 450μmのスライスと氷上に置き、組織培養プレートに短縮ガラスパスツールピペットを用いてそれらを転送する - 350を準備します。
5. ピンセットを使用して、慎重に各スライスからアガロースを削除し、Millicellの文化膜に移す。約4スライスは、培養液6 mLで満たされた10cmの組織培養プレートの1つの膜上で培養することができる。
6. 37スライスをインキュベート℃、5％CO _2（培養培地：DMEM、25％1X HBSS、25％ウシ胎児血清、0.5％グルコース、1mMのグルタミン、2.5mMのHEPES、pHは7.3）。いずれかのタイムラプスイメージング系列1を実行する場合媒質定数の体積を保持する必要があります。短い時間枠のための時限イメージングシリーズのケースでは、そのままメディアを残すのに十分です。より長い培養期間のために12〜20時間後の変更は推奨されています。

パート4：顕微鏡でイメージング脊髄神経突起伸長。

1. 直立蛍光顕微鏡下でのスライス、とMillicell培養膜を含む、10cmの組織培養プレートを配置し、画像脊髄神経。
2. 次の撮影時間の時点の間に正しく配置するために顕微鏡のステージ上Millicellの文化膜の方向にラベルを付けます。
3. 4 × 10倍（開口数[NA] 0.1）、（NA 0.3）、または20倍（NA 0.5）の目標を使用してイメージ脊髄神経突起伸長。

図1は、4倍、10倍の目標と文化の20時間の間に脊髄神経の伸長を描いたイメージングシリーズを示しています。

ホモ接合tauGPFの胚の横スライスで脊髄神経の突起伸長の図1イメージングシリーズ。腹側脊髄の* =運動ニューロン、矢印= DRG。スライスの背側（D） - 腹側（V）軸が示されています。スケールバー：200μmの。

In an extensive comparison of methods to prepare embryonic slice cultures of mid-gestation mouse embryos (E10 - E12), we have observed that a vibratome produces without question the most reliable results with respect to both the overall viability of the cultures and the reproducibility of the nerve outgrowth patterns. In contrast, slices prepared using a McIlwain tissue chopper³ proved to be completely inviable. We originally employed a guillotine method⁴, in which an entire litter of embryos could be simultaneously prepared by slicing with tungsten wires wrapped serially around a cutting grate to produce 400-μm sections¹. Although this technique had the advantage of speed of preparation, it yielded at most one viable section per embryo and showed a large amount of variability in outgrowth parameters. For these reasons, we feel that a vibratome-based method is the superior choice despite the longer time in preparation. Although this solution by necessity requires a vibratome, the results are vastly superior to what has been achieved through other "low-tech" approaches, and thus justifies the investment.