発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

サマリー

高効率、信頼性の高い方法 in vitroで発現と培養ヒト胚性腎細胞における組換え電位依存性イオンチャネル（HEK - 293T）のその後の電気生理学的記録。

要約

in vitro発現と培養ヒト胚性腎細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録（HEK - 293T） におけるユビキタス研究の戦略です。彼らは、隣接セルとの接触による交絡影響することなく電気生理学的記録を可能にするために、互いに接触していないようにHEK - 293T細胞は、十分に低い密度でカバーガラス上にプレーティングする必要があります。トランスフェクトされたチャネルは、ノイズレベルを超える検出可能な電流の細胞全体のパッチクランプ記録のための細胞膜に高効率で表現しなければなりません。異種イオンチャネルは、多くの場合、十分な膜発現を達成するために28℃でトランスフェクション後にCを長い潜伏期間が必要ですが、この温度で​​細胞カバースリップの接着と細胞膜の安定性の損失が高まっている。この問題を回避するために、我々は、トランスフェクションとプレートHEK - 293T細胞に最適化された戦略を開発した。このメソッドは、セルが28で比較的高いコンフルエントでトランスフェクトされた、とインキュベートされている必要があります°十分なイオンチャネルタンパク質の発現を可能にするために潜伏期間後のトランスフェクションを変えるためのC。トランスフェクトした細胞をガラスカバースリップ上に播種し、37℃でカバーガラスと膜のrestabilizationに硬い細胞接着を可能にするいくつかの時間、インキュベートする。細胞はすぐにメッキの後に記録することができます、または° C、さらにインキュベーションを28に転送することができます。我々は28時の初期インキュベーション℃で、トランスフェクション後、メッキの前には、通常は細胞膜でも発現しない異種イオンチャネルの効率的な発現のための鍵であることがわかります。積極的にトランスフェクション、培養細胞は、単に上流の内部リボソーム侵入部位およびEGFPをコードする配列のcDNA組換えイオンチャネルを含むバイシストロンベクター（例えばpIRES2 - EGFP）から発現共発現EGFPまたはeGFPので識別されます。ホールセルパッチクランプ記録は、特殊な装置を必要とする、加えて洗練された記録電極とホウケイ酸ガラスからL字型の接地電極の策定。イオンチャネルの薬理学を研究する薬物送達は、直接録音皿に薬をmicropipettingことにより、またはmicroperfusionまたは記録された細胞を介して薬液の中断のないストリームを生成する重力流システムを使用することによって達成することができます。

プロトコル

1。細胞の文化

1. 10で補足した。ダルベッコ改変イーグル培地（シグマアルドリッチDMEM）の6mLを含むヒト胚性腎臓293T細胞（HEK - 293T、Invitrogen社）ベント25センチメートル²フラスコ（グライナーバイオワン; Cellstar扱わ組織培養）で接着単層で増殖させる％（v / v）のウシ胎児血清（FBS;シグマアルドリッチ）、1％ピルビン酸ナトリウム、および37で250μg/ mLのペニシリン/ストレプトマイシン° Cで5％CO _2）。
   
   細胞は、いずれの37℃または28℃に設定したCO ₂インキュベーター（5％CO _2）でインキュベートする細胞を持つすべての作業は、層流フード内で行われます。
   
   
2. 細胞は通常、月曜日は1:8の希釈で、〜90％コンフルエントから、隔週分割、および木曜日午前1時12分されています。 （異なる密度で播種したHEK - 293T細胞の画像については、図1を参照）
3. 分割の場合、メディアは、吸引によって細胞のフラスコから除去され、そして細胞は、° C倒立フラスコに37に加熱トリプシン（シグマアルドリッチ）ソリューション液1mLを適用することによって分離されます。フラスコを手で、その後反転し、緩やかに揺り動かしているトリプシン溶液で数回接続されたセルの上に移動するように。トリプシンは、その後速やかに吸引除去され、トリプシンの250μLのは、再び細胞上のトリプシン溶液を移動させる揺動されるフラスコにmicropipettedています。
4. フラスコは、CO ₂インキュベーター中でインキュベートする37℃に設定さ3-5分のためのC、及びピペットは暖かいDMEM培地の4mlの中で細胞を停止するために使用されます。不完全なトリプシン処理し、懸濁液を、細胞の塊が発生し、細胞が意図した単層で上向きにしていない成長する可能性があります。オーバートリプシン処理は細胞を損傷する恐れがあります。
5. 1:8分割の場合、浮遊細胞の500μLのDMEM 5.5mLを含む新しいフラスコに添加されているを追加します。1時12分割のために（図1を参照）、細胞の333μLをDMEMの5.7mLを含む新しいフラスコに添加されています。フラスコを穏やかに37℃のインキュベーターに転送して混合される。 37 3 - 4Hインキュベートした分割後のCの間に、細胞が沈殿し、フラスコに付着する。細胞は最初にラウンドに見えますが、しっかりしたアタッチメント（図1）で拡張子（偽足）を平らにし、必要があります。
   
   細胞は、予測可能な方法で接着単層で生育してください。細胞増殖および外観は、非定型または一貫性のない、貧しい人々の技術や汚染（細菌/マイコプラズマ）考慮すべきでなければならない。成功した組織培養への鍵は一貫性です。
   
   

2。組換えイオンチャネルcDNAをHEK - 293Tのトランスフェクション

1. ここでは、様々なイオンチャネルからのcDNAが強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）蛍光を経由して積極的にトランスフェクションされた細胞の同定を可能にするプラスミドpIRES2 - EGFP（BDバイオサイエンスクロンテック）にクローニングされています。 EGFPはすぐ下流のcDNAおよびEGFPをコードする配列（図2）の上流に挿入の内部リボソーム侵入部位で開始した翻訳を通じて、cDNAをクローニングしたインサート、同じ転写産物からのトランスフェクションした細胞で生産されている。積極的にpIRES2 - EGFPコンストラクトのカルシウムチャネルサブユニットをトランスフェクトした、蛍光HEK - 293Tの画像については、図3を参照してください。
2. 前のトランスフェクションに、完全にコンフルエントフラスコは、新しいフラスコに1:4に分割され、そして細胞を37での接続を許可されています° CをCO ₂インキュベーターで3〜4時間のために（図1を参照）。
3. セルが接続された後、標準のリン酸カルシウムトランスフェクションの戦略（コールドスプリングハーバープロトコル）はHEK細胞へのイオンチャネルとアクセサリーサブユニットのcDNAを含むコンストラクトを導入するために使用されます。一般的に、フラスコ/トランスフェクションごとに使用されるトランスフェクション溶液のISEの600μLのDNAの12μgの合計。
4. トランスフェクション液を細胞滴以上のピペッティングした後、フラスコを一晩37℃のインキュベータ内に配置されます。
5. 以下のトランスフェクションは、細胞は慎重にして徐々に上のように洗浄溶液の移動を直立フラスコを回して、フラスコを揺らし、倒立フラスコに洗浄溶液をピペッティングすることにより（4-5 mL）を緩衝生理食塩水暖かいメディアまたはリン酸で3回洗浄する細胞。これは注意深く行われていない細胞がデタッチ可能性があり、いくつかは、次の3つの洗浄ステップの後に残される。洗浄は、メディアの6mlの後、さらに2回繰り返され、フラスコに添加し、それを37でインキュベートされた℃で2時間のためのCを、その後28に転送℃のインキュベーターが。
6. pIRES2 - EGFPコンストラクトの成功したトランスフェクションは、1〜3日落射蛍光顕微鏡を用いてトランスフェクション後に確認することができます。紫外線にさらされると緑色の蛍光を発する細胞が積極的にトランスフェクトされ、異種のイオンチャネルとEGFPタンパク質を発現してください。

3。メッキは、電気生理学的記録に備えてHEK293T細胞をトランスフェクト

NT">異なるイオンチャネルは、HEK細胞の細胞膜において異なる効率で発現し、そのようなものとして、このプロトコルの残りの部分は成功し電気生理学的記録を可能にするチャネルの表面発現を最大にするために、いくつかの最適化が必要です。HEK細胞における異種イオンチャネルの発現、特に非哺乳動物源からのものの、（1）長い時間を必要とする大規模なタンパク質のサイズは、変換と形質膜（2）不在または哺乳類に必要なチャネルタンパク質でモチーフを折り曲げるとターゲットの類似度にローカライズするを含むいくつかの課題を提示することが細胞株（3）種から種へのコドン使用頻度の違い。組み合わせてこれらすべての要因が28で長いインキュベーション時間のための要件が​​発生すること·セルの分裂せずに効果的なタンパク質発現と表面局在を確保（外希釈だろうれるC、異種cDNAおよびタンパク質）。残念ながら、28で長時間のインキュベーション° Cは、細胞の剥離と電気生理学的記録が困難に乏しい膜の安定性につながります。私たちは、インキュベーションを最小限にするために（トーマスとSmart、2005年にレビュー）従来のトランスフェクションの戦略を変更することを決定28℃で前に録音すると表面発現を最大にする。提案手法は、細胞を28に3-7日の期間インキュベート、トランスフェクションされている必要があります° C、その後、細胞をトリプシン処理によって切り離さとカバースリップの上に色を保ち続けると37℃でインキュベートされています°膜をrestabilizesとカバースリップ上の細胞の強力な付着を可能にする。細胞は、その後すぐに記録することができる、または28で時間の追加の期間インキュベートすることができます℃まで我々は、この後の段階でカバースリップ上の細胞の再播種を見つけるCチャネル発現の高い番号、別の付着細胞とカバーグラスを製造するために必要不可欠であることが私たちの方法では

我々は2つ​​の代替戦略、我々はイオンチャネルおよびトリプシン消化（例えばCav3電位依存性カルシウムチャネル、Senatoreとスパッフォード2010）に対して脆弱である可能性のある大きな細胞外ドメインが含まれていないイオンチャネル複合体に使用することを好むものを提示する、一我々は大きな細胞外ドメインが含まれて行うイオンチャネルのために使用すること（例えば、L -型電位依存性カルシウムチャネルとその付属品のサブユニット;。Senatore、ら 2010）。

1. 1. 細胞を28℃で細胞分裂を防ぐため、翻訳されたタンパク質の蓄積を可能にするために2-6日間インキュベートされています。表面発現は、チャンネル"新生mRNAとポリペプチド配列はそれぞれ、翻訳機構と分泌経路と相互作用する方法を指示本質的な要因に依存しているので、このインキュベーション時間は、各イオンチャネルのために経験的に決定する必要があります。
   2. プレーティング前に、円形のガラス製カバースリップ（サークル1号-厚さ0.17ミリメートル〜0.13、サイズ：12ミリメートル、フィッシャーサイエンティフィックカナダ、オタワ、オンタリオ州）があたり、メーカーの指示として、ポリ- _L -リジン（Sigma）でコーティングされている。
   3. メディアは、トランスフェクションされた細胞から吸引除去され、37の1 mLを° Cトリプシン溶液（シグマ社製）倒立フラスコ（アップセル側）にmicropipettedています。フラスコを穏やかにトリプシンは細胞上で実行できるように直立位置に反転され、そしてフラスコを再び反転し、トリプシンを吸引によって除去される。暖かいトリプシンの250μLは、直接セルに追加され、フラスコは細胞のデタッチされるまで3〜5分間37℃でインキュベートする。
   4. 一方、ポリ- _L -リジンコートしたカバースリップは、6ミリメートル培養皿（シャーレ当たり3-8）に配置され、暖かい培地5mLをそれぞれの皿に追加されます。
   5. トリプシン処理細胞はピペッティングによって暖かい培地の4mlのに再懸濁する〜6回、その後再懸濁した細胞の250 -500μLカバースリップを含む培養皿にmicropipettedされています。細胞を添加する前に、マイクロピペットの先端は、彼らは皿の底にあることを保証するためにカバースリップを下にプッシュするために使用されます。
   6. 次に、細胞を3時間℃で、それらをカバーガラスに付着するように37℃でインキュベートし、そしてそれらが28℃に転送されます。この時点で、細胞は理想的に別個に接続された細胞（図3は、カバースリップの上にメッキする前と後にトランスフェクトされた細胞を示す）で行われる電気生理学的記録、のための準備が整いました。 37長すぎるために細胞を残すことは° Cは、細胞分裂になります。
2. 1. 大きな細胞外ドメインとチャネル/チャネル複合体を発現する細胞の調製は、カバーグラスを28℃でインキュベートされることを除い°電気生理学的記録が行われる前に、追加の2-4日間のためのCと、上記のようにほぼ同じ方法で実施される。これは、チャネル/チャネルCの再蓄積を可能にトリプシン処理後の細胞膜でomplexes。

4。 HEK - 293T細胞における組換えチャンネルの電気生理学的記録

いくつかの包括的なリソース電気生理学的記録の基礎となる一般的な概念を説明する（例えば、オグデンとスタンフィールド1987; Molleman 2003）ことが可能です。

4.1電気生理学リグ

、Digidata 1440A pClamp10.1と一緒にアナログ - デジタルコンバータのインターフェースを搭載したPCのコンピュータ、典型的な電気生理学的リグ（図4）アンプ（アクソンインスツルメンツ、ユニオンシティ、カリフォルニア州などAxopatch 200Bまたは700BアンプをMulticlamp）が含まれていますソフトウェア（Molecular Devices社、サニーベール、カリフォルニア州）、電動、デュアルピペットマニピュレータ（MPC - 385 - 2、サター器械公司）、落射蛍光顕微鏡（Axiovert 40 CFL、ツァイスカナダ、トロント、オンタリオ州）と血流のシステム（図4と図5 ）。振動はTMC 63から500シリーズの防振台（テクニカルマニュファクチャリング株式会社、ピーボディ。MA）に機器を取り付けることにより制限されています。浮遊電気的ノイズは、防振台に搭載された電気機器を取り巻く40"背の高いタイプIIファラデーケージ（TMC）を使用して制限されています。電子制御システム（コンピュータ＆モニター、アンプ、アナログ - デジタルコンバータ、電動マニピュレータとのようなValvelink潅流コントロールシステム）、自立型金属電気ラック（ハモンドマニュファクチャリング、エルフオンタリオ州）へのファラデーケージの外側に取り付けられています。すべての電気機器は、銅の代理店に接地し、メディカルグレードのアイソレーショントランスを（1800W、トリップLiteに接続されている線の分離、一貫性のある地上及びサージ抑制を提供するUL60601 - 1）。

4.2パッチピペット

フィラメント（; BF150 - 86 - 15; 1.5ミリメートルOD、OD 0.86ミリメートル、15センチメートル長サター器械公司）とホウケイ酸ガラス毛細管を半分にカットし、フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーモデルP - 97（サター器械公司）に挿入されます。 （ピペットを個別の細胞膜に対するタイトなシールを可能にするピペットチップの表面を滑らかに磨かれた発射され、ピペットプラープログラムは一貫して地面に電極から2〜5MΩ（図6火災の研磨後）の間に抵抗を持つピペットを生成するために最適化されていますマイクロフォージMF - 830、成茂、日本、図6）。マイクロピペットは、特殊なホルダー（; Molecular Devices社、サニーベール、カリフォルニア州1 - HL - U）でステージ上に搭載されています。

4.3接地電極

パッチピペットを作るために使用されるホウケイ酸ガラス管は、参照電極を作るために使用されています。 15センチメートル長い管は3個に切断されています。ガラスは可鍛性になるとチューブが90度の角度で"L"または"ホッケースティック"の形に曲げることができるまで2先の細いピンセットで、真空管は、ブンゼンバーナーの炎で開催されています。ガラス管がまだ熱いですが、一方の端はすぐにホット3M CsCl及び毛管作用によってチューブに描かれている1.5％アガロース溶液に浸漬される。参照電極が完全に溶液を充填されると、それは冷たい水のビーカーに入れられます。参照電極のすべてがいっぱいになった後で、それらは個別に外部から余分なアガロースを削除するにはキムワイプで拭いていると3M塩化セシウム溶液中に浸漬されています。 3M塩化セシウムの溶液で満たされた電気生理学的記録については、参照電極は、微小電極ホルダーハーフセル（世界プレシジョンインスツルメンツ（株）、サラソタ、フロリダ;＃MEH3RF15ホルダー90 Fペレット1.5mm）の内に保持されています。 （浴溶液の接地電極の図は、図7を参照）

4.4電気生理学的記録のソリューション

電位依存性イオンチャネルの種類が異なると、イオンの透過性/選択性に応じてさまざまなレコーディングソリューションが必要です。電位依存性カルシウムチャネルの場合、セルは通常、種々の濃度のバリウムまたはカルシウムのいずれかを含む外部のソリューションを浴びています。例えば、無脊椎動物Cav3電位依存性カルシウムチャネル（LCav3）の電気生理学的記録は、TEA - OHで7.4に調整したpHを5mMのCaCl _2を 、166mMテトラエチルアンモニウム（TEA - Cl）を、10mMのHEPESを含む外部のソリューションを使用して実行することができます。パッチピペットは125mmの塩化セシウム、10mMのEGTA、2mMのCaCl _2を 、1mMのMgCl _2を 、4mmのMgATP、0.3mmのトリス- GTP、および7.2（Senatoreとスパッフォード、2010）のpHの10mMのHEPESの内部溶液で満たされている。脊椎動物L -型電位依存性カルシウムチャネル（LCav1）は電荷担体（15mmのBaCl2、1mMのMgCl _2を 、10mmのHEPES、40mmのTEA - Clを、72.5mM塩化セシウム、10mMのグルコース、と同様にバリウムを含む外部のソリューションを使用して記録することができます。 TEA - OH）と108mMのCs -メタン、4MMのMgCl _2、9mmのEGTA、9mmのHEPESを含む内部溶液を7.2に調整したpHは、pHはCsOH（Senatore らを7.2に調整。、2010）。

4.5全細胞記録

1. トランスフェクトした細胞を（異種イオンチャネルやイオンチャネル複合体を発現する）を含むカバースリップは、外部録音ソリューションの〜3MLを含む35ミリメートルのプラスチックペトリ皿に移している。薬の既知量をマイクロピペットでシャーレに追加される薬の実験を行う際に、記録液の体積を正確に測定する必要があります。研究者が実験に応じて、この温度を変更することが電気生理学的記録は、通常、室温で行われている。
2. 細胞は、落射蛍光顕微鏡で可視化し、隔離された、積極的にトランスフェクション、付着緑の細胞は、視野の中央にセンタリングされます。
3. パッチピペットは、パッチピペットの電極と参照電極との間の回路を完了マイクロマニピュレーターを用いて浴溶液、に低下する。バスモードのときに、pClamp10.1ソフトウェアは、ピペットと参照電極との間の小繰り返し電圧ステップを生成するためにアンプを引き起こし、方形波のトレース（図8A）とその結果生じる電流を表示します。この方形波のトレースは、パッチを適用するセルの前にアンプのオフセットピペットを使用してゼロにしなくてはならない。ピペットの抵抗はpClamp10.1ソフトウェアによって測定され、そして2 - 5MΩ内にある必要があります。
4. バスモードのときに、ピペットが方形波のトレースの急激な変動として可視化できる細胞、の近接に持ち込まれ、その後吸引の小さな量はピペットとの間にgigaohmシールを形成するためのパッチピペットに適用されます。膜（方形波のトレースの完全なフラットラインを引き起こす、図8B）。
5. プログラムは、パッチモードに切り替えられ、そしてピペットの容量は、（フラット現在のトレースの先頭と末尾のエッジ上の現在の小さいブリップとして目に見える、図8B）アンプのピペット容量の補償で補償されます。
6. 吸引の小さいながらもシャープな量が破裂するパッチ内膜を適用し、細胞の内側への電極のアクセスを許可されています。成功した膜の破裂は、現在の波形のトレース（図8C）の先頭と末尾のエッジ上の大容量過渡の外観によって示されます。いったん達成された突破、プログラムセルモードと全セル容量の補償に切り替えられるが、容量のトランジェントを除去するために、アンプに調整されます。録音に先立って細胞内に細胞内記録液の平衡を可能にするために数分間の遅延があります。
7. 電圧指令が生成され、データがpClamp10.1ソフトウェアと組み合わせてDig​​idata 1440Aアナログ - デジタルコンバータのインターフェースを装備したコンピュータを使用して取得されます。ユニークな電圧クランププロトコルは、各実験のために書かれており、これらはトランスフェクトした細胞からのイオンチャネル電流を記録するために使用されます。図9は、無脊椎動物LCav3電位依存性カルシウムチャネルを発現しているHEK - 293T細胞から記録されたカルシウム電流を示しています。セルは、+20 mVの- 70mVの間、および増分depolarisations - 110mVの電圧で開催された内向きカルシウム電流を引き出すために取られた。
8. 記録された電流は、ローパスベッセルフィルタを使用して、10 kHzで、ろ過し、2 kHzのサンプリング周波数でデジタル化されています。最小限のリーク（<10％）を持つ唯一の録音は、分析に使用され、そしてオフラインリーク減算がClampfit 10.1ソフトウェアを用いて行われる。

記録された細胞のうち4.6薬物の研究

薬は直接記録されて皿に分注したことがあります。薬の量が追加された場合の薬の濃度を計算することができ、浴溶液の量が知られている。薬剤の高価または限定された量は、テフロン弁を通して作動either 8つのチャンネルSmartsquirt圧マイクロ灌流システム（自動化サイエンティフィック）や重力流システムを使用して、250ミクロンremovable先端が灌流鉛筆ポリイミドマルチバレルマニホールドからmicroperfusionによって追加される可能性がありますとValvelink8バルブコントローラ（科学自動化、灌流システムのセットアップについては、図5を参照）。 microperfusionシステムからの流量は、灌流の鉛筆記録されたセルから400ミクロンを出るストリームで毎分0.1mlをに設定されています。記録電極の先端からの血流鉛筆の先端の距離は、パッチからパッチに一貫している必要があります。図10は、40倍の倍率で表示されて提案された距離を示しています。十分な流量が記録された細胞の飽和灌流を提供しています。薬の実験がmicroperfusionを使用して行われる前に、細胞は連続的なストリームの制御浴溶液のmicroperfusionと平衡状態にある。ストリームの中断を最小限に抑え、制御バス、薬剤や洗浄液からの迅速な切り替えにより、実験中に回避されます。記録皿の端に取り付けられた吸引はtを使用することができます。Oは、注射器または蠕動ポンプ駆動装置（例えばMINISTARミニチュアDC蠕動ポンプ、世界の精密機器）の使用について、マニュアル吸引によって、ソリューションのオーバーフローを削除します。非常に急速な血流が現在のカルシウム（鵬ら、2005）を変更することがせん断力を誘発するので注意を払う必要があります、記録されているセルを洗い流す、と早すぎると薬剤リザーバを激減することがあります。

直接皿対灌流システムにペッティング

	直接ピペッティング	マイクロ灌流システム	重力流の灌流システム
必要なボリュームの薬剤	中等度の	低	高
テクニカルスキル	低	中	中
機器コスト	低	な	な
セットアップとクリーンアップの日々の時間	なし	20 +分	20 +分
装置の汚染	なし	はい	はい
トラブルシューティング	簡単	複雑	複雑
皿の保証薬	はい	なし	なし
薬物添加して細胞を失う	はい	はい	はい
薬のコンクを大幅に削減。洗浄することにより	困難	簡単な	簡単な
複数の用量応答曲線を行うことの容易さ	最適では	簡単な	簡単な
結果の再現性	OK - pippetingの位置に依存	良好な	良好な

ディスカッション

記載されているプロトコルとソリューションを使用して、細胞全体の電流を記録するためにできることは、トランスフェクションが成功したことを、所望の電圧依存性イオンチャネルやイオンチャネル複合体は細胞膜でかなりの量で存在していることを示しています。細胞は積極的にトランスフェクト（すなわち蛍光緑）が記録可能な電流、28で追加のタイム° Cが適切にパッケージ化し、細胞膜に挿入されるチャネルタンパク質を可能にするために必要となる場合がありますが持っていない必要があります。 28でその長時間のインキュベーションを注意してください°パッチクランプ記録は、より困難なこと、Cは細胞がカバーガラスからデタッチされます、そして膜が死んだ細胞からごみを不安定化して蓄積する。このプロトコルで提案されている時間のすべては、私たちの特定のチャンネル用に最適化されています。他のチャネルとそのサブユニットは、より長いまたはより短いインキュベーション時間を必要とするかもしれません、そして、必要に応じて我々のプロトコルは、さらに調整することができます。特定のチャネルのために貧しい人々のトランスフェクション効率は、（すなわち少ない蛍光細胞と細胞当たりの低蛍光強度）を効率的にトラン...

材料

材料	会社	カタログ番号	コメント
pIRES2 - EGFPプラスミド	クロンテック	6029から1
サークルガラスカバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-80	丸1号 - 厚さ0.17ミリメートル〜0.13、サイズ：12ミリメートル
アンプ	アクソンインスツルメンツ	Axopatch 200BまたはMulticlamp 700B
データ収集システム	アクソンインスツルメンツ	Digidata 1440A
電気生理学ソフトウェア	アクソンインスツルメンツ	pClamp10.1
ピペットマニピュレータ	サター器械（株）	MPC - 385から2
落射蛍光倒立顕微鏡	ツァイスカナダ	Axiovert 40 CFL
ヘッドステージ	アクソンインスツルメンツ	CV - 7B
ヘッドステージの電極ホルダー	アクソンインスツルメンツ	1 - HL - U
接地電極のための微小電極ホルダー	世界の精密機器	MEH3RF 15
電気生理学キャピラリーチューブ	サター器械（株）	BF - 150 - 86から15	フィラメント、OD 1.5ミリメートル、外径0.86ミリメートル、長い15センチメートルとホウケイ酸ガラス
/ブラウンマイクロピペットプラーフレイミング	サター器械（株）	P - 97
マイクロピペット火災ポリッシャー	ナリシゲ	マイクロフォージMF - 830
マイクロ薬剤灌流系	サイエンティフィック自動化	SmartSquirt8 Valvelink8.2
薬剤の潅流システム	サイエンティフィック自動化	テフロンバルブ付きValvelink8.2