ザリガニ後腸との生理学的実験：学生実験室実習

サマリー

本報告書では、ザリガニの後腸の生物を調査するために使用できる手法を示します。私たちは、ザリガニの腹部を解剖し、関連する解剖学、生理学および活性の調節を研究する方法を示します。収縮の蠕動運動と強さは力変換器を用いて測定している。

要約

レポートの目的は、ザリガニ後腸を準備するために解剖の技術を記述すると、収縮の強さを監視する力変換器との生理学的記録を作成する方法を説明することです。さらに、我々は視覚的に様々なペプチド、生体アミンと神経伝達物質のバイオアッセイとして使用できる蠕動運動を、監視する方法を示します。この準備は、生理学で、学生に薬理学的概念を実証するための学生の研究室に適している。この準備は、100年以上にわたって使用されていて、それはまだ蠕動リズムの生成と規制を調査し、その変調のメカニズムを記述するためのモデルとして多くを提供しています。現在でも研究に貢献する腸で50年以上前に開始された薬理学的アッセイと受容体のサブタイピング。この堅牢な調製は、生理学や薬理学の訓練の学生に適しています。

プロトコル

1。はじめ

ザリガニ後腸の最新の包括的な概要については、セロトニン変調と神経支配（Musolf ら 、2009年に主に焦点を当てた博士バーバラE. Musolf（2007年、ジョージア州立大学、アトランタ、ジョージア州、米国）、で論文に遵守され）。甲殻類のhindgutsは、最初に彼らの神経支配の様々な側面を説明するAlexandrowicz、比較解剖学の先駆者（Alexandrowicz、1909）、100年以上も前に検討した。研究は、全体の動物のための浸透圧調節における後腸の全体的な機能に対処する、筋肉の層とアーキテクチャの種類を識別する、長年にわたって継続し、そして種々の化合物（Musolf、2007年までのレビューを参照）により、後腸の収縮の調節制御を検討。それは後腸の肛門部分が糞を排出するだけでなく、浸透圧調節のための環境から水を取ることだけでなく、働くことに注意することは興味深い。腸内のこの領域は、前方に受けるか、動物のニーズに応じて、蠕動運動を逆にすることができます。

Alexandrowicz（1909）甲殻類の後腸、内側の神経叢と後の神経伝達物質を同定し、特徴付けるための豊富な情報源であることが証明外側叢を、支配するtwo神経叢を同定した。 1950年代に博士エルンストフローリーでザリガニ後腸に対する薬理学的研究のシリーズを開始し、収縮はアセチルコリンとその関連化合物によって、また、エピネフリンとノルエピネフリン（フローリー、1954）によって変調されることを実証した。フローリー、として知られている抑制物質の発見者"因子- Iは、"ザリガニのGIシステム（フローリー、1961）を含む種々の製剤、この物質の効果を調べた。因子- Iは、後でGABAであることが示された。このように、ザリガニ後腸は、​​シナプス抑制の初期の研究において重要な役割を果たした。

GABAの発見に続いて、他の推定トランスミッタはまた、後腸の神経叢に関連付けられていることが示され、生理学的反応を誘発する。 、proctolin（RYLPG - OH。メルシエら 1997）は、2つorcokininペプチド（NFDEIDRSGFGFNとAFDEIDRSGFGFN。Bungart ら1994;。。Dircksenら 2000）、このような送信機は（Elofsson ら1968。Elekesら 1988）ドーパミンが含まれています、orcomyotropin（FDAFTTGFamide;。Dircksenら 2000）とmyosuppressinのペプチド（メルシェら1997;。。。おそらくpQDLDHVFLRFamide、CF Stemmler ら 2007）。これらの物質の各々は、自発的な腸の収縮を変調し、GABAを除くすべては、興奮性のように見える。後腸はまた（。ジョーンズ、1962;間違ったら、2003）グルタミン酸とキスカルに応答しますが、グルタミン酸作動性神経支配のための明確な証拠は報告されていない。様々な送信機の効果を仲介細胞内のメッセンジャーは、主に未踏、しかし収縮（Knotz＆メルシエ、1995）強化するドーパミンの能力におけるcAMPの関与の証拠があるされています。

自発的に以下の除神経甲殻類の後腸の契約ですが、そのような収縮は、一般的に（; Winlow＆ラベラック、1972aウェールズ、1982）弱いと無秩序です。ぜん動運動は、明らかに最後の腹部神経節に由来する中枢神経系、（Winlow＆ラベラック、1972a、b、c）をより調整モーターの出力を必要とします。ザリガニでは、モータの出力は、細胞体の最後の腹部神経節（近藤＆久田、1986）に局在している75の軸索を含む⁷日腹部ルート、通過後腸に運ばれる。少なくともペプチドのいくつかは、最後の腹部神経節由来の神経細胞から後腸神経叢に供給されるように見えます（Dircksen ら2000;。。メルシエら 1991b; Siwicki＆ビショップ、1986）が、ドーパミンは、より多くのの神経細胞によって供給される前神経節（メルシエら 1991a）。 ^第 7 ^回腹部ルートを介してモーターの出力が大きい、協調収縮のために必要なので、上記の推定送信機の一部またはすべてが蠕動運動に何らかの形で貢献している可能性があります。それらの相対的な寄与は、しかし、知られていない。いくつかの洞察力は、別々に円形と縦筋（メルシエ＆リー、2002年）に及ぼす影響を研究することによって得られます。

未消化の食物の動きの制御に加えて、甲殻類の後腸に関連する神経叢には、脱皮に関連する重要な内分泌機能を果たしている。カニ、Carcinus maenas、の後腸は水の吸収の役割を示唆し、脱皮に関連する腫れ、脱皮（ウェブスターら、2000）中に、甲殻類の血糖上昇ホルモンとその関連する前駆体のペプチドを放出内分泌細胞が含まれています。このように、甲殻類の後腸は、いくつかの重要な生理学的プロセスに参加しています。

このレポートは、主に先進的な高等学校や実験に参加生理学コースの学部学生のための教育ツールです。重要性だけでなく、後腸の契約や機能が学生によって対処することができる方法の背後にある潜在的なメカニズム。薬理学的作用物質、神経伝達物質、および神経ホルモンが使用され、用量反応曲線は、生理学的および薬理学的データを取得し、解釈する方法で学生を従事れる、構築されます。アゴニストおよびアンタゴニストに関する受容体の機能の一般的な理解も達成することができます。学生はまた、統計分析のためのグラフィカル形式でデータを提示する方法を学習します。

ザリガニ後腸から収縮を細かく分析し、記録するのは非常に簡単です。解剖の準備では、腸が簡単に外因性物質にさらされています。蠕動運動の変化を視覚的にまたはまた収縮の力を監視することができる力変換器、と監視することができます。ためにバイオアッセイの準備として、そのシンプルさと信頼性から、ザリガニ後腸は、​​蠕動運動のメカニズムは、モーターの出力と筋収縮の調節、および受容体の機能に関する多くの研究課題を調査するため、まだ非常に便利です。後腸は、アクションの特定のメカニズムのために殺虫剤、crustaceancides、および汚染物質をテストする場合にも便利です。

2。の方法

2.1）材料

• ザリガニ
• ザリガニ生理食塩水
• 解剖の楽器（粗い＆細かいハサミ、粗い＆細かい鉗子）
• Sylgard底ペトリ皿
• ピンを解剖鋼
• ビーカー（薬液を保持する）
• パラフィルム（ソリューションをカバー＆ミキシング用）

2.2）解剖

1. ボディの長さが6〜10センチメートルを測定ザリガニ（ ザリガニ ） は解剖が始まる前に動物を麻酔するために5〜10分間氷上に置く必要があります。
2. 片手で爪の背後から麻酔ザリガニを保持する。迅速に、目のソケットから両側頭部の中央にカットし、ザリガニ（注：準備から血液が完了したときときに乾くので、ツールを洗うスティッキーになるだろう）を刎ねる。
   
   図1：ザリガニの斬首
3. chelipedsと歩いて足を切り取ります。
4. 唯一中央の尾翼（腹肢を）残して、左と右のtailfinsを切り取ります。
5. ザリガニの背側で背側クチクラの左側と右側の両方に腹側にカット。
   
   図2：背キューティクルの除去
6. カットはその後、背側腹部表皮の下の部分を削除GIへの損傷を防ぐために浅いことを確認し、キューティクルの背側に横方向にカット。
7. Sylgard裏地皿に切除したザリガニを置きます。
8. 尾翼の先端に皿にザリガニを固定。一つは、身体を保持するために必要に応じてGIの両側に多くのピンを使用することができます。
9. GIは、継続的にピペットを用いて生理食塩水でGIを消すために確認してください網羅ザリガニの生理食塩水で皿を埋める。 5.3 mMの塩化カリウム; 13.5 mmのCaCl _2を 2H ₂ O、2.45 mMのMgCl ₂ · 6H ₂ O、生理食塩水は、205 mMのNaClで作られている修正ヴァンHarreveldのソリューション（1936年）であり、5mMのHEPES、pHを7.4に調整する。解剖ザリガニは、図3に示すように表示されます。
   
   図3：そのままGIとディテールに秘められたザリガニ。

2.3）実験

2.3.1）、動物の収縮

1. 準備や入浴の生理食塩水と同じ温度で試験される化合物の解決策を持っている。には、セロトニンの個々の溶液（100 nMの、1microM）、グルタミン酸（1microM）、そしてテストされる出発物質として、ザリガニの生理食塩水で行われたドーパミン（1microM）を使用する場合があります。
2. 約10分間ザリガニのソリューションに座って切開ザリガニが、それが解剖と生理食塩水暴露の衝撃に調整したりすることができます。後腸からゆっくりと蠕動の収縮が発生して開始する必要があります。
3. 収縮が開始すると、30秒（：つまり蠕動のタイプ、または痙性、及びいかなる蠕動波の方向に発生する収縮の種類に注意）で発生する収縮の数を記録。
   表1：ザリガニ生理食塩水の収縮
   

   収縮の数	収縮の種類

4. πを使用するpetteは、ザリガニの露出腹部の空洞内に生理食塩水を削除し、後腸に直接検査する物質を含む生理食塩水を適用します。
5. すぐに解決策を追加した後、30秒後に発生する収縮の数を記録し（すなわち蠕動、または痙性）が発生収縮の種類に注意してください。
   表2：化合物への曝露による収縮
   

   化合物は、テスト	濃度	収縮の数	収縮の種類

6. すぐに被験物質に対する応答を記録した後、通常のザリガニの生理食塩水でGIを数回すすいでください。ザリガニの生理食塩水で30秒ごとに約すすぎながら、準備は、5分間放置する。
7. ピペットを用いて、検査される、次の化合物または後腸に直接テストした最後の物質の様々な濃度を含むいくつかの生理食塩水を置きます。低濃度及び高濃度までの作業を1つの方法で開始するのが最善です。
8. すぐにそれぞれの新しい物質や、それぞれの新しい濃度​​を追加した後、30秒後に発生する収縮の数を記録し、収縮の種類に注意してください。

2.3.2）摘出した製剤中の収縮の記録部隊

図4：設定

1. ブリッジのポッドにトランスデューサを取り付けます。
2. PowerLab 26Tにブリッジのポッドを取り付けます。
3. コンピュータのUSBポートにPowerLabの26Tを取り付けます。
4. デスクトップ上のlabchart7アイコンをクリックして[開くLabChart7、。
   • LabChartウェルカムセンターボックスが開いているポップアップ表示されます。それを閉じます。
   • セットアップをクリックしてください
   • チャンネルの設定をクリックしてください。 [OK]を押す（ボックスの左下）を1にチャネル数を変更します。
   • チャートの左上に約2kに秒あたりのサイクル数を設定します。約500または200 mVにボルト（y軸）を設定します。
   • チャートの右側にチャンネル1をクリックしてください。入力アンプをクリックしてください。シングルエンド、AC結合、および反転（必要に応じて信号を反転します）、およびアンチエイリアス、チェックされます：。設定がいることを確認してください
   • 記録のプレススタートを開始する。
5. 準備をピックアップし、胸部と腹部の間に岐路に消化管をカット。その後、慎重に尾の尾節の部分の周りにカット。解剖ザリガニから消化管を取り外し、Sylgard皿に入れてください。消化管の背側面に沿って走る血管があります。慎重に消化管から離れてこれを引っ張る。準備の上に新鮮なザリガニの生理食塩水を注ぐ。
6. 解剖ザリガニの近くにクランプの力変換器を置きます。
7. 図5に示すように、ザリガニGIで力変換器を引っ掛けます。
   
   図5：力変換器のフックに接続されている生理食塩水でザリガニの隔離された後腸
8. GIは、契約を開始するまで待って、とLabChart7でスタートを押してください。
9. プログラムは約20秒間実行してみましょう。 "生理食塩水のみ"、"、停止"とラベルの付いたコメントを追加押し込みます。表4に必要事項を記入。
   表4：目的の化合物と収縮
   

   収縮の数	収縮の振幅（mVの）

10. 興味の試験化合物を追加し、直ちにLabChart7で"start"を押してください。
11. プログラムは約20秒間実行してみましょう。プッシュは、"停止"とどのような物質を添加し、その濃度にされたチャートのファイルに直接コメントを追加。下の表に記入してください。
    表5：_________化合物と収縮
    

    収縮の数	収縮の振幅（mVの）

12. ピペットを使用してザリガニの生理食塩水と準備を洗い流す。
13. 同様に他の物質や種々の濃度を追加。すぐにLabChart7で"start"を押してください。
14. プログラムは約20秒間実行してみましょう。 "、停止"と直接Cを示すグラフファイルのコメントとラベルを追加するプッシュ使用すると濃度ompound。

3。データ解析

1. 実験の2.3.1から、グラフの各溶液（生理食塩水、セロトニン、グルタミン酸）対時間から収縮の数。傾向を説明する。
2. 実験の2.3.2から、グラフの各溶液（生理食塩水、セロトニン、グルタミン酸）対mVで収縮の振幅から収縮の数。傾向を説明する。

収縮の速度と力の測定3.1）

インデックスに収縮の速度はたわみで先頭から次の開始までの時間を測定したり、分または2つ以上の総たわみを数えることができます。値は、それらが発生しているか迅速に応じて毎分または毎秒収縮の条件に入れることができます。

インデックスに収縮の力が相対的な尺度は、異なる条件を比較するために使用することができる。保存されたファイル上の1つはマーカー"M"を使用することができますし、ベースラインに移動。その後、たわみのピークにカーソルと移動を使用し、デルタ値（Mからピークまでの差）として画面の右上に記載されている値をメモしておいてください。カーソルが変化の測定のための静止状態に維持する必要がある注意してください。その後、関心の次の波の形にMを移動し、測定を繰り返します。

ディスカッション

関連するムービーとテキストで提供される詳細情報は、 その場で同様にin vitroでのザリガニの後腸の活動を記録するために必要な主要な手順を説明します。私たちの報告書の一つの目標は、生理学や薬理学の基本的な概念を教えるの調査研究室を学生実行するにはこの準備の可能性への意識を高めることです。

これらの製剤は、腸の生理機能の理解につながる実験的な質問の数を調査するために使用することができます。蠕動波とその反転の制御のメカニズムはまだ知られていない。全体の消化管の高い制御のためのメカニズムも十分に理解されていない。高次中枢が直接GIシステムを制御する自律神経出力で彼らの活動を統合する方法の質問は、調査のオープンエリア（シュラーノワら 、2006）のまま。さらに、甲殻類の後腸と脱皮し、環境ストレス時の浸透圧調節の機能の浸透圧調節機能が十分に解明されていない。この準備の答えを待っている多くの疑問が残っています。

材料