これは、生体膜が電気的モデルを用いて理解する方法のデモンストレーションです。我々はまた、学生の志向の研究室でザリガニの腹神経索から活動電位を記録するための手順を示しています。
この記事について
サマリー
要約
これは電気的モデルが生体膜を特徴付けるために使用する方法のデモンストレーションです。この演習では、また、電気生理学で使用されている生物物理学用語を紹介します。同装置は、ライブの準備上に膜モデルで使用されています。分離された神経索の一部のプロパティを調べています：神経活動電位、神経細胞の採用、および環境要因への神経索の応答性を。
プロトコル
1. はじめに
1.1) 背景
電気回路の基礎知識は、生理学的な実験や理論の多くの側面を理解し概念化するための有用なツールとなります。この演習は、電圧源、電気抵抗、および電気容量に関するいくつかの一般的原理に習熟することを目的としています。これらの導入概念は、シナプス伝達や神経線維に沿った電気信号の伝播といった現象を理解するための基礎となります。
注意点：金属線と抵抗器で構成される標準的な日常の電気回路では、電流は負の電荷を持つ電子によって運ばれます。一方、生物学的システムでは、電流は1つ以上の正または負の電荷を持つイオンによって運ばれます。慣習的に、電流は正から負へと流れます（もちろん、実際には電子はその逆方向に移動します）。
回路の構成要素は、生体組織の電気的特性、および場合によってはその研究に関与する無生物（電極など）の電気的特性を表しています。
演習を進める際は、結果と計算内容をメモしておいてください。
1.2) 一般原則
直流が流れる電気回路の基本特性は、オームの法則によって記述されます
V = IR
ここで、V = 電圧（V）
I = 電流（A）
R = 抵抗（Ω）
この法則は、電極を用いて神経細胞で観察される電位を規定するものです。まず、オームの法則と、生体材料におけるその応用について実演します。
1.3) 材料
| 項目 | 分量 |
| ブレッドボード | 1 |
| 抵抗器：330 KΩ | 1 |
| 100 KΩ | 12 |
| 33 K Ω | 6 |
| 22 kΩ | 1 |
| 10 KΩ | 6 |
| 4.7 KΩ | 1 |
| 2.2 kΩ | 1 |
| 1.5 KΩ | 1 |
| 1 kΩ | 1 |
| 510 Ω | 1 |
| 330 Ω | 1 |
| 220 Ω | 1 |
| 150 Ω | 1 |
| 100 Ω | 1 |
| コンデンサ： 0.1 μF | 6 |
| : 10 μF | 6 |
| 配線 | 12 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLab出力リード | 1 |
| PowerLab入力リード | 1 |
| 電圧計（電流測定可能） | 1 |
抵抗器カラーコード表
| 色 | 数字 |
| 黒 | 0 |
| 茶 | 1 |
| 赤 | 2 |
| オレンジ | 3 |
| 黄 | 4 |
| 緑 | 5 |
| 青 | 6 |
| 紫 | 7 |
| 灰 | 8 |
| 白 | 9 |
| 銀 | 許容誤差 10% |
| 金 | 許容誤差 5% |
1st バンド - 1st 指
2nd バンド - 2nd 指
3rd バンド - ゼロの数
4th バンド - 許容誤差
図 1：システムセットアップ。コンピュータ、ブレッドボード、および出力刺激装置を備えたパワーラボ。
本実験では、PowerLabシステム（AD Instruments社、オーストラリア製PowerLabインターフェース）を電圧源として使用します。PowerLabのUSBケーブルをコンピュータに接続し、PowerLabの電源を入れ、デスクトップからLabChartプログラムを開きます。「New File」を選択します。複数の記録チャンネルが表示されたウィンドウが現れます。上部の「Setup」を選択し、「Channel Settings」をクリックします。ウィンドウの左下隅でチャンネル数（Number of Channels）を1に減らし、チャンネル1の範囲（Range）を5 Vに変更します。2本のミニフックリードが付いたスティミュレーターケーブルをPowerLabの出力（Output）ポートに接続します。赤色のコネクタケーブルを正の出力ポートに、黒色のコネクタケーブルを負の出力ポートに接続します。次に、PowerLabの出力電力、周波数、およびパルス幅を変更する必要があります。そのためには、「Setup」を選択し、次に「Stimulator Panel」を選択します。実験の最初のパートでは1.5 Vの長時間パルスが必要なため、振幅（amplitude）を0.75 Vに調整します。これにより1.5 Vの範囲となります（PowerLabは正負0.75 Vの間で変動する電圧を出力します）。周波数を0.5 Hzに、パルス幅（pulse duration）を1 sに設定します。
図 2: ブレッドボードの回路図。側面のカラーストリップは、同じ色のものはすべて1つのユニットとして接続されています。中央の2つの水平列は、各行のそれぞれの半分で接続されていますが、中心線を越えたりサイドストリップに接続されたりすることはありません。中央の各行は、次の行から独立しています。
ブレッドボードを使用する場合、入力および出力リード用に両側に2つの列があります。一般的に、正極は右側の正極列に接続され、その列内のすべての穴は互いに接続されています。負極入力はブレッドボードの反対側に接続され、ここでも同様に、1つの列内のすべての穴が接続されています。2つの列セットの間にある中央部分には、5つのセルからなる複数の行があり、それぞれの行は他から独立しています。5つのセルで構成される1つの行内のすべてのセルは接続されていますが、他の行からは絶縁されています。図2を参照してください。ハイライトされた領域は、ブレッドボードのどの部分が相互に接続されているかを示しています。ブレッドボードの使用に関する有用なビデオは、オンラインの http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related で視聴できます。
演習 1
オームの法則を用いて、次の回路を流れる電流を計算してください。
電流 (ネットワーク 1): ________________A
演習 2
上記回路（ネットワーク 1）における抵抗器の両端電圧、抵抗値、および流れる電流を測定してください。
図 3: Wavetek Meterman 電圧計。
1500 Ωの抵抗器を用いて、ブレッドボード上にネットワーク1を再構成します。電圧源（1.5 V）にはPowerLabを使用します。電圧、電流、および抵抗の測定には電圧計を用います。電圧計で正確なデータを収集するためには、赤と黒の両方のプローブが回路内のむき出しの導線に接触している必要があります。また、ダイヤルはDC電圧に合わせ、個々の実験セットアップのスケールに適した範囲に調整してください。電圧を測定する場合は、電圧計の両プローブを抵抗器の両端に当てます。抵抗器の抵抗値（電圧降下ではなく）を測定する場合は、電圧源を切り離し、再度両プローブを抵抗器の両端に当ててください。電流を測定する場合、電圧計を回路に直列に挿入する必要があります。その際、電流の流れに対して赤と黒のプローブが正しく配置されていることに注意してください。
電圧 (ネットワーク 1): ________________V
抵抗 (ネットワーク 1): ________________Ω
電流 (ネットワーク 1): ________________A
次に、電圧計で行ったのと同様に、Power Labを用いてネットワーク2（ネットワーク1と同様ですが、ブレッドボード上に構築されています）の両端電圧を測定します。電圧計を取り外し、赤と黒のクリップが付いた電圧測定プローブのリード線を接続してください。次に、カーソルを使用して画面右側の「Channel 1」をクリックします。「input amplifier」を選択し、ボックス内の「differential」ボタンをクリックして、レンジを5 Vに設定します。「OK」をクリックして変更を保存します。
右下の「Start」をクリックしてデータを収集します。電圧変動を測定するために、いつでも停止させることができます。収集された電圧を測定するには、「Stop」をクリックし、左下の「M」カーソルをドラッグしてベースラインに移動させます。次に、自由カーソルを電圧トレースの頂点に移動させて振幅を測定します。電圧の変化（ΔV）を読み取り、データを紙に記録してください。結果は単体の電圧計で確認できます。
1.4) 直列における抵抗とコンダクタンス
分圧回路の原理：直列に接続されたすべての抵抗の合計にかかる電圧降下は、電源電圧に等しくなります。個々の抵抗にかかる電圧は、全抵抗に対するその抵抗の割合によって決まります。したがって：
一対の抵抗は、それぞれの抵抗値の比率で電圧を分圧します。
演習 3
ネットワーク3における各抵抗器の電圧降下を計算してください。1.5 V電源を接続した状態で、電圧計およびPowerLabソフトウェアを用いて実際の電圧を測定し、計算結果を確認してください。
ネットワーク 3。上記で指定された2つの抵抗器を使用してください。
| 計算値： | 測定値： |
| 電圧（R1間）：_______V | 電圧（R1間）：________________V |
| 電圧（R2間）：_______V | 電圧（R2間）：________________V |
1.5) サンプルの生物学的応用：
活性化した神経細胞の細胞内部と外部溶液の電気的特性が異なることは、分圧回路の一例となります。この生体回路は、外部電極を用いた記録を通じて探究することが可能です。イオンが流入する神経細胞の活性領域は電圧源として機能し、電流はこの領域から細胞内部に沿って流れ、外部溶液を通って戻ります。したがって、電位が異なる膜上の2点間には電流が流れており、必然的に繊維の内部と外部で同じ電流が流れます。内部の抵抗は外部の抵抗よりも大きいため、最大の電圧降下はこの内部で発生します。
この系とその等価回路について考えます（図4：AおよびB）：
等価回路：
図4：A（上）生物学的細胞膜を横切る電流の電気的流れ。B（下）等価電気回路。電圧源（120 mV）は、神経細胞の活動電位によって生成される膜電位である。
注：電源の位置により、R0とRiは実際には（並列ではなく）直列に接続されています。この回路の等価な図は以下の通りです：
図5：図4Aの別の等価電気回路。
演習 4.
以下の条件が与えられているとする：
膜電位 Vm = 120 mV
内部液の抵抗 Ri = 106 Ω
外部液の抵抗 R0 = 104 Ω
電極AとBの間の電位 V0を計算せよ。
V0: ________________V
演習 5
ネットワーク4（以下に参照）を使用して、各抵抗器（R0およびRi）の両端の電位を測定してください。
ネットワーク4：4.7 K Ωおよび10 K Ωの抵抗器を1.5 V電源に直列に接続します。
電圧計で電圧を測定してください。
電圧（R0の両端）：________________V
電圧（Riの両端）：________________V
ネットワーク 5 : R0 = 1 K Ω 以外はネットワーク 4 と同じ
ネットワーク 5 では、外部抵抗が大幅に低くなっている（大量の液体や不活性組織が電極を分流させている状態に相当する）ため、外部抵抗を高めるために神経を空気中または絶縁油中で記録することが重要である点に注意して下さい。
電圧 (R0 間): ________________V
電圧 (Ri 間): ________________V
1.6) 直列および並列における抵抗とコンダクタンス
生物学的応用の例：
直列および並列抵抗の好例として、化学伝達シナプスの電気的構成が挙げられます。ほとんどのシナプスでは、シナプス間隙の分流効果（シャント効果）のため、電気的伝達は不可能です。しかし、この分流は、シナプス前膜に大きな電位を発生させ、それに伴う伝達物質の放出を可能にするために必要であると考えられます。
図 6：シナプスを介した電気化学的フローのモデル。
生体組織内では、細胞膜や制限された細胞外空間において、大きな電気抵抗が生じることに注意してください。細胞質や浸漬液などの比較的広い液体空間は、有意な抵抗にはなりません。
演習 6。
ネットワーク 6（上記および回路基板を参照）は、化学伝達シナプスのアナログモデルです。電気伝達シナプスでは、シナプス間隙（シャント抵抗 Rs）が排除されており、電流は Rm1 および Rm2 を経てシナプス前細胞からシナプス後細胞へ直接流れ、その後 Rm3 を通過します。ネットワークの減衰は、さまざまな抵抗値を用いて容易に測定でき、異なるシナプスにおける変化を例示できます。PowerLab を 1.5V（すなわち 0.75 Volt 設定）に接続してください。
- マルチメーターを使用して、提供されたネットワーク内の各抵抗器の両端の電位差（PD）を測定してください。抵抗器の値を記録します。Rm3（ポストシナプス細胞の膜）の両端の電位差を特に記録してください。電圧：________________V
- Rsにある 330 Ω の抵抗器を 330K Ω の抵抗器に交換します。Rm3の電位差を測定してください。
- 次に、Rsを 330K Ω に維持したまま、Rm2にある 330K Ω の抵抗器を 33K Ω の抵抗器に交換します。Rm3の両端の電位差を測定してください。電圧：________________V
- 次に、Rsを 330K Ω、Rm2を 33K Ω に維持したまま、R m1にある 22K Ω の抵抗器を 220 Ω の抵抗器に交換します。Rm3の両端の電位差を測定してください。電圧：________________V
演習 7
直並列抵抗ネットワークの例は、神経または筋線維のケーブル特性を検討する際に現れます。線維の長さ定数（LENGTH CONSTANT）とは、膜を挟んだ電位差（PD）が元の値の 37% まで低下する距離のことです。この減衰は、膜の両側にある液体の内部抵抗および外部抵抗が、（相対的に高い）膜の横方向抵抗によって分流されるために起こります。この抵抗値によって、神経細胞の軸索に沿った信号の伝達が制限されます。長さ定数は、指数関数的減衰で測定される 1/e に相当します。dE/dT=-E/RC（ここで E は電圧差、R は抵抗、C は容量）となります。あるいは別の形式では E=Eoexp (-t/RC)（ここで Eo は開始電圧、t は秒単位の時間）と表されます。RC はタウ（τ）、すなわち時定数とも呼ばれます。
外部液の抵抗が細胞内および膜抵抗に比べて無視できると仮定すると、膜の受動的な抵抗特性は以下の回路で表すことができます。
図7：ネットワーク7をブレッドボード構成に変換したもの。
ネットワーク7のAとBの間にある一方の端に電圧を印加します。刺激装置を使用し、パルス幅1s、振幅1V（0.5 Vに設定）、周波数0.75Hzを選択します。各「膜」抵抗の両端に順次電圧計を接続し、その抵抗にかかる電位差（PD）を記録します。電圧計プローブの一端を（Aリード、赤）に固定したまま、もう一方のリードを位置1から5まで順に移動させます。各値を、電位差（PD）を縦軸、光源からの「距離」を横軸としたグラフにプロットします。このとき、膜抵抗の間隔を単位距離とします。グラフから、この回路の長さ定数を決定してください。
ネットワーク7の長さ定数のグラフ：______________
髄鞘によって生じるような膜横方向抵抗の増加、または線維径の増加に伴う線維内部の縦方向抵抗の減少による効果は、長さ定数の変化として現れます。抵抗値は神経軸索で実際に測定される値ではありませんが、ほぼ比例しています。同様に、モデル上の「単位距離」は、実際の神経細胞から大幅にスケールアップされています。
1.7) 静電容量
コンデンサは電荷を蓄えます。抵抗を介してコンデンサに電圧を印加すると、コンデンサに電流が流れ、コンデンサ両端の電位差（PD）は電源の電位差に向かって時間とともに指数関数的に上昇します。この電圧変化の時間経過は、印加電圧、静電容量、および直列抵抗に依存します。コンデンサが放電するときには、同様ですが逆の経過が見られます。
この簡単な抵抗-容量（RC）ネットワークの入力部（AおよびB）をスティミュレーターに接続します。持続時間1s、周波数0.75Hzの1V（0.5Vに設定）パルスを使用します。また、サンプリングレートを20 K /sec（パネルの右側）に設定する必要があります。PowerLabの入力クランプをコンデンサの両端に接続します。数秒間データを収集し、停止させます。Zoomウィンドウを使用して、矩形パルスの一つの立ち上がり時間を拡大します。波形を広げるために、ズームインを数回繰り返す必要がある場合があります。ベースラインから、電圧波形が平坦になる直前の頂点までの立ち上がり時間を測定します。電位変化の時間経過と、矩形パルスの歪みを観察してください。10μFのコンデンサを0.1 μFのものに変更した際の影響を観察します。PowerLabの電圧プローブを抵抗の両端に接続することで、回路を流れる電流の時間経過を観察できます。数パルス分だけ収集し、停止させてから測定します。「M」カーソルを立ち上がり前のベースラインに移動させ、フリーカーソルを電圧が平坦になり始める位置に合わせます。
最後の例では、抵抗成分と容量成分の両方が関与します。神経線維や筋線維の受動的なケーブル特性は、細胞膜の特性に由来する同様の要素によって決定されます。細胞内には横方向の膜抵抗が存在するだけでなく、細胞膜の電気的特性により膜容量も存在します。この影響により、電気的に伝播する電位の発達の時間経過が変化します。
例：
このネットワークは、膜抵抗（Rm）に必要数コンデンサを並列に接続することで、ネットワーク 7 から構築できます。
演習 8。
ネットワーク 7 に 10 μF のコンデンサを接続します。刺激装置を A と B に接続し、1s、1V（0.5 V 設定）、0.75Hz のパルスを用いて、各膜抵抗の両端における電位変化を観察します。「閾値」電圧（神経細胞で活動電位が発生する電圧）を 0.2V と仮定し、各膜抵抗で電位が閾値に達するまでの時間を測定します。ここでの閾値とは、生細胞において活動電位が発生し得る電位値を意味します。結果を「距離」に対する時間としてプロットしてください。
図 8：ブレッドボードへのネットワーク 9 の実装。
図8のグラフ。
より容量の小さい0.1μFのコンデンサに交換することで、髄鞘の厚さの増加によって生じる膜容量の減少の影響をシミュレートします。選択した抵抗器において、閾値に達するまでの時間の変化を確認してください。このデータを、容量の大きいコンデンサを使用した場合と同じグラフに重ねて表示します。
筋細胞膜に関しては、T管に伴う膜表面積の増加によりキャパシタンスが増大し、ニューロンと比較して膜キャパシタンスが大きくなると考えることができます。また、無髄神経軸索に髄鞘が加わることでキャパシタンスが減少することを説明するために、より小さいキャパシタを用いることができます。ここで学ぶべき主要な点は、電気容量（キャパシタンス）は表面積に比例し、キャパシタの「極板」または蓄電面を隔てる誘電体層（髄鞘）の厚さに反比例するということです。
モデル回路で示された特性は、生体試料で観察されます。しかし、細胞は膜を介した漏洩や軸索抵抗などの特性において個体差があります。中には活動電位を発生させない細胞もあります。しかし、細胞の受動的な電気特性によって信号は数ミリメートルで減衰するため、数ミリメートル以上の距離に信号を伝達する必要がある場合には、活動電位が生成されます。次の一連の実験では、活動電位の記録について説明します。
1.8) 学生への質問
- ニューロンおよび筋細胞における空間定数の一般的な値にはどのようなものがありますか？
- 膜抵抗が低い膜の場合、時定数（最終値の63%に達するまでの時間）は変化しますか？変化する場合、膜抵抗が低くなると時定数はどのように変化しますか？また、時定数（tau）の一般化された数式は何ですか？
- イカの巨大軸索のような太い軸索は、なぜ同じイカの標本内の細い軸索よりも電気信号を速く伝導できるのでしょうか？
2. 神経細胞の伝導特性
2.1) ブレッドボードから生細胞へ
回路基板の演習で示された受動的特性は、生細胞においても測定可能ですが、神経細胞において活動電位を伴う場合、これらの受動的特性を分離して抽出することは困難な場合があります。ニューロンの能動的特性とは、静止膜電位を維持し、活動電位を発生させ、それを膜に沿って伝播させる能力のことです。
神経索に沿った電気的フローは、個々のニューロン内、およびニューロン間において再生的に伝播することがあります。ザリガニの腹側神経索（VNC）では、一部のニューロンがセプテート接合（すなわちギャップ接合）を介して通信しています。ブレッドボードを用いた以前の演習で示されたように、抵抗値を変化させると電気信号の伝導が妨げられます。これは、腹側神経索内のギャップ接合を通過する電流の流れを変化させることと同様です。
次の一連の実験では、VNCにおける複合活動電位の伝導速度およびその他の特性を検討します。ここでは、実験用のVNCの採取方法と、学生向け実習用に設計された標準的な装置を用いて反応を誘発し、測定する方法について解説します。
2.2) ザリガニの標本作製
ザリガニの腹側神経索はこの実験に最適です。この神経は解剖しやすく、また伝導に影響を与えるさまざまなプロトコルをこの標本で適用できます。実験を開始する前に、以下のザリガニの解剖学的用語に習熟してください。
図 9. ザリガニの一般的な解剖図。
改変元：http://www.enchantedlearning.com
2.3) 神経における伝導の背景
ザリガニの腹側神経索は、尾部跳躍反応などの逃避反応を開始させる信号の伝達を担っています。本実験では、完全な状態で維持された神経索全体から記録を行います。神経索内の各ニューロンからの個々の電位が合算されることで複合活動電位が生じ、これが記録ソフトウェアに表示される測定可能な電気パルスとなります。Erlanger, Gasser, and Bishop (1924) は、複合活動電位について記述した先駆者の一部です。ここでは、不応期の特性、伝導速度、およびギャップ結合阻害剤である 1-heptanol や温度による神経への影響を示します。神経細胞信号の基本原理を学ぶことは、全般的な神経機能のより深い理解に寄与します (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe and Grundfest, 1961)。
2.4) 材料
| 項目 | 量 |
| 大型ザリガニ（Procambarus clarkii) | 1 |
| 精密解剖用ハサミ | 1 |
| ピンセット | 1 |
| MLT016/X 神経チャンバー | 1 |
| Scopeソフトウェア搭載ノートパソコン | 1 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLabアンプリファイア | 1 |
| PowerLab用スティミュレーター出力ケーブル | 1 |
| USB PowerLab/コンピュータコネクタ | 1 |
| 吸引電極付きマニピュレータースタンド | 1 |
| 球付きガラスピペット | 1 |
| ザリガニ生理食塩水を入れたビーカー | 1 |
2.5) 方法
2.5.1) 解剖
ザリガニの解剖を行う前に、神経解剖用ディッシュ、各種器具、および溶液が準備されていることを確認してください。
- ザリガニを湿らせたペーパータオルで包んで固定するか、または親指と人差し指で鉗脚（chelipeds）を挟んで片手で保持します。
- もう一方の手を使い、眼窩の間の額角に沿ってハサミで切開します。
- 切開箇所から下方へ切り進み、頭部を完全に切断します。
- 頭胸部の基部から腹部にかけて切開し、尾部を取り除きます（必要に応じて、この工程を容易にするために鉗脚と歩脚を取り除いても構いません）。
- 腹肢を取り除きます。
- 腹部の腹側両端に沿って切開します。深部の組織を損傷させないよう注意してください。
- 腹側神経索を露出させるため、切り離した外骨格の部分を尾扇の基部まで剥がします。
- ピンセットの先を用いて、腹側神経索の先端から慎重に取り出します。神経索を伸ばしたり押し潰したりしないよう注意してください（神経索に見られる結節はザリガニの神経節です）。
- 神経チャンバー内の金属バーの上に神経索を配置します。腹側神経索を常に湿らせておくことが不可欠です。そのため、金属製クロスバーと同じ高さになるまで十分な量のザリガニ用生理食塩水を神経チャンバーに加えます。次に、液面がバーの底にちょうど接する程度まで、ザリガニ用生理食塩水をピペットで吸い出します。
ザリガニ用生理食塩水 (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl2.2H2O; 2.45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES, pH 7.4に調整) - 神経を配置した後、2本のミニフックリード付き刺激装置ケーブルを神経チャンバーに取り付けます。正極の赤色リードを神経索端付近の外部金属ループの1つに、負極の黒色リードを神経索に接している最も近い隣接金属ループに取り付けます。
- マニピュレーター内の吸引電極を、神経の反対側の端付近に配置します。
- 腹側神経索の先端を記録電極の中に慎重に吸引します。
2.5.2) 記録
神経索の先端を記録電極内に吸引させた後、電極がプローブに接続されており、プローブが十分に接地されていることを確認します。これは、接地ケーブルをファラデーケージに接続することで簡単に行えます。正および負の吸引電極ワイヤーも、プローブの corresponding な位置に接続する必要があります。プローブは差動増幅器に接続し、さらに増幅器をPowerLabに接続します。
吸引電極からの電気配線をヘッドステージに接続します。配線は、左上に赤（正極）、中央に緑（接地）、下に黒（負極）となるように接続してください。これは、以下のヘッドステージに関する図10に示されています。接地線は生理食塩水槽に入れておくだけで構いません。したがって、吸引電極からの1本の線を+入力へ、もう1本の線を-入力へ接続します。吸引電極からのどちらの線を+または-入力に接続しても問題ありません。
図 10：ヘッドステージの入力端子
アンプの設定は以下の通りです：
| コントロール | 設定 |
| ハイパスフィルタ | DC |
| ノッチフィルタ | OFF |
| ローパスフィルタ | 20kHz |
| 容量補正 | 反時計回り |
| DCオフセット微調整および粗調整ノブ | 反時計回り |
| DCオフセット (+OFF) | OFF |
| ゲインノブ | 50 |
| 入力 (DIFF MONO GND) | DIFF |
| モード (STIM-GATE-REC) | GATE |
| ΩTEST | OFF |
付属のUSBケーブルをPowerLabの背面とコンピュータの出力端子に接続します。コンピュータのデスクトップにあるScopeソフトウェアを開きます。画面右上の「Channel 2」を選択し、オフにします。画面中央のバーを下にスライドさせ、Channel 1のみが表示されるように画面を調整します。次に、画面右上のChannel 1の「Input Amplifier」をクリックし、以下を選択します：
| 対照 | 設定 |
| 範囲 | 500 mV |
| 交流 | 確認済み |
| ローパス | オフ |
| シングルエンド | 確認済み |
| 反転 | 確認済み |
次に、再び「Set up」の下にある「Sampling」をクリックします。表示された画面の「Sweep」という項目で、以下を選択してください。
| 制御項目 | 設定 |
| モード | 複数 |
| サンプル | 100 SWEEPS |
| ソース | ユーザー |
| ディレイ | 0 SECONDS |
最後に、「Set up」タブで「Stimulator」を選択します。ボックスをクリックして「Isolated Stim」をオフにします。以下の設定を選択してください：
| 制御項目 | 設定 |
| モード | マルチプル |
| 遅延時間 | 5 ms |
| 持続時間 | 1 ms |
| パルス数 | 2 |
| 間隔 | 15 ms |
| レンジ | 5 V |
| 振幅 | 0.5 |
右側のパネルにある「Time Base」を確認してください。「Sample」を1024に、「Time」を200 msecに変更します。
図 11: Scopeソフトウェアで記録された、刺激間隔 15 msec の2つの複合活動電位。
演習1。
画面左下の「Start」ボタンを選択します。上記の設定であれば、Scopeデータ収集ボックスに明確に定義された複合活動電位が表示されるはずです（図11）。下のグラフに活動電位の一般的な形状を描き込んでください（図12）：
図 12：複合活動電位の形状を描き込むための白紙グラフ。
画面左上のタブを使用して、電圧をゆっくりと下げます。活動電位の振幅は徐々に小さくなり、最終的にその特徴的な波形も消失します。電圧を下げることで、複合活動電位の発生に関与するニューロンの数が減少するためです。一般に、太い軸索はより低い電圧で動員され、伝導速度が速いため、複合活動電位において最初に現れる傾向があります。逆に、電圧を段階的に上げると、より多くのニューロンが動員されるため、複合活動電位の波が大きくなる逆の効果が観察されます。この演習は、個々のニューロンが活動電位を発生させるための閾値が異なることを示しています。刺激電圧を上げても複合活動電位がそれ以上増加しなくなったとき、すべてのニューロンが動員されたことになります。このとき、コンピュータ画面上の活動電位波に2つの明確なピークが見えるはずです。
演習 2
ニューロンの動員とそれに伴う複合活動電位を確認した後、不応期の影響を観察します。これは、2つの刺激を時間的に短く間隔を空けて与え、刺激間隔を変化させることで行えます。そして、2番目の刺激によって誘発される複合活動電位の振幅が、1番目の複合活動電位と比較して減少する刺激間隔を観察します。画面左上のタブを使用して、パルス間の遅延時間を変更してください。2番目の複合活動電位が誘発されなくなるまで、遅延時間を短くし続けます。2番目の活動電位がもはや誘発されないパルス間の時間が、絶対不応期です。絶対不応期の終了から、2番目の刺激が最大振幅の活動電位を発生させるまでの時間が、相対不応期と呼ばれます。提供された空白に、絶対不応期と相対不応期の推定値を記入してください。
絶対不応期：___________________
相対不応期：___________________
2.5.3) 伝導速度の測定
ミリ定規を用いて、記録電極に最も近い刺激電極と記録電極との間の距離を測定します。記録されたトレースから、複合電位における各イベントのピークまでの時間を測定し、さまざまな電気信号の伝導速度を記録できるようにします。単位をm/secにするため、距離（mm）をメートルに、時間（msec）を秒に換算してください。
1番目の波形伝導速度：__________________
2番目の波形伝導速度：__________________
3番目の波形伝導速度：__________________
4番目の波形伝導速度：__________________
2.5.4) ギャップ結合および／または伝導速度の操作
次に、神経抑制剤の特性を調査します。ヘプタノールの脱共役作用は、Johnston et al. (1980) によってザリガニの隔壁軸索（すなわちギャップ結合）で初めて報告されました。この電気的伝達に関連する作用は、その後、さまざまな脊椎動物および無脊椎動物の系で確認されました (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986)。この腹側神経索における電気的伝達の役割を理解するために、(1mM) 1-heptanolを含む生理食塩水を用いてギャップ結合を脱共役させることができます。ガラスピペットを用いて、ヘプタノール溶液で神経索全体を洗浄してください。Scope記録ソフトウェアで記録される変化を観察し、それをまとめてください（波形の変化、および波形の伝導速度が変化したかどうかに注目してください）。あるいは、1-heptanolを使用する代わりに、浸漬液を氷冷生理食塩水に交換し、波形または波形の伝導速度に生じる変化をモニタリングすることも可能です。
ディスカッション
オンラインビデオプレゼンテーションと本論文で我々の目標は、細胞の生物物理学的特性が、一部では、電気回路としてモデル化できることを実証することです。さらに、比較的容易に得られるライブ神経組織で、伝導速度、不応期および電気生理学的記録技術の基本原則は、設備のささやかな投資と学部学生の研究室でも利用が可能だ。提示テーマと根本的なパラダイムは、容易に様々なコースの要件に合わせて変更することができます。
ザリガニとその豊かさの維持管理は、それらの学生主導の実験のための魅力的なモデルです。甲殻類の腹側神経コードは一般的に強固であり、3時間の学生実験室には十分です時間の最小限の生理食塩水、で生理的整合性を保持。
ザリガニのVNCの大きな軸索の一部がギャップ結合を介して接続されていることを考えると、彼らの貢献についての追加実験を行うことができる、そして標準的なカエル坐骨神経標本に見られるとは異なる性質を発揮することができます。坐骨神経は、複合活動電位と伝導特性に対処するための古典的なモデルです。それも、伝導特性、軸索の採用、そしてこれら二つの製剤の間に不応期を比較する学生のための興味深い比較実験かもしれない。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
これらの実験は、コースで使用されている実験室のマニュアル、トロントの動物学、大学の学科で、博士HLアトウッドによって編成から変更されました。演習も使用して、"基礎神経科学第 6 回集中IBROワークショップ"のために制作されたと1993年に高麗大学、ソウル、韓国（Cooper ら 、1993）で開催されたマニュアルから変更されました。現在の変更は、さまざまな大学で一日の学生向け研究室を提示する一般的な機器を使用する必要がありました。ケンタッキー州の大学、生物学科、学部及び芸術科学大学のOfficeでサポート。
材料
サーキットボード
- ブレッドボードの実験のために以下に記載されている電子は、ラジオシャックなど、地元の電気店で入手できます。
- ブレッドボード、抵抗、コンデンサ、電池、実験で概説したようにブレッドボード用ジャンクションとして機能するワイヤー。
- 共通の電圧計（Wavetek Meterman電圧計）
- コンピュータへのライン録音のためのA / Dボード。電気信号は、PowerLab/4sインタフェース（ADInstruments、コロラドスプリングズ、コロラド州、米国）への行に記録されます。我々は、チャートまたはScopeというADInstrumentsから標準のソフトウェアを使用してください。
生理学実験
- ザリガニ（ ザリガニ ）。アチャファラヤ生物サプライ（株）、レースランド、LA。、米国。
- 標準的なザリガニ生理食塩水：ヴァンHarreveldのソリューション（1936）から変更された。 （mMで）205のNaCl、5.3 KClを、13.5のCaCl 2 2H 2 O、2.45のMgCl 2 · 6H 2 O、5 HEPES、pHを7.4に調整。すべての生理食塩水の化学物質は、シグマケミカル社（セントルイス、MO）から得た。
- 解剖ツール：ファイン＃5ピンセット、細かいはさみ、ナイフの刃ホルダー、＃26002から20虫ピン（すべてのファイン科学のツール（米国）、（株）、373 - Gビンテージパークドライブ、フォスターシティー、CA 94404から1139から取得）
- 神経を保持するために神経のチャンバー皿（ADInstruments、コロラドスプリングズ、コロラド州、米国）。神経チャンバー皿に付属のワイヤは、神経を刺激するために使用することができます。
- 吸引電極は、信号を記録するために使用されます。
- マニピュレータやリングスタンドにクランプでも吸引電極用ホルダーとして機能します。
- ファラデー箱
- 解剖顕微鏡
- 高輝度の照明装置（光源）
- 顕微鏡プラットフォーム
- AC / DC差動アンプ（AMシステムズ社モデル3000）
- PowerLab 26T（ADインスツルメンツ）
- 細胞外アンプ（ADインスツルメンツ）
- LabChart 7（ADIインスツルメンツ）
- 解剖ツール
- リングは、記録の吸引電極用ホルダーとして機能するように立っているとクランプ
参考文献
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