我々は、末梢血単核細胞由来のヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流の全細胞パッチクランプ記録のためのステップバイステップのプロトコルを提供しています。
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この記事について
サマリー
要約
Tリンパ球で、細胞内Ca 2 +ストアからのCa 2 +枯渇は、カルシウムのリリース-活性化カルシウム（CRAC）チャネルと呼ばれる細胞膜のCa 2 +チャネルの活性化につながる。 CRACチャネルは、T細胞の増殖と遺伝子発現の調節において重要な役割を果たしている。 T細胞の異常なCRACチャネル機能は、重症複合免疫不全や自己免疫疾患1、2にリンクされています。ヒトT細胞のCRACチャネルの機能を研究することは正常な免疫反応を調節する新たな分子メカニズムを明らかにし、関連するヒト疾患の原因を解明することができる。膜電流の電気生理学的記録は、機能的なチャネルのプロパティとその規制の最も正確な評価を行うこと。 Jurkat T細胞、ヒト白血病T細胞株、のCRACチャネル電流の電気生理学的評価が最初に20年以上前に3を実行された、しかし、正常なヒトT細胞におけるCRAC電流測定は困難な課題である。正常T細胞でCRACチャネル電流を記録するの難しさは、血液由来のTリンパ球は、Jurkat T細胞よりもはるかに小さいサイズと、従って、内因性の細胞全体のCRAC電流は振幅が非常に低いものであるという事実によって悪化されています。ここで、我々は日常的に健康なボランティアの末梢血から単離されたヒトT細胞の休止のCRACチャネル経由でのCa 2 +又はNa +電流を記録するために使用するステップバイステップの手順を与える。ここで説明する方法は、Jurkat T細胞および活性化ヒトT細胞4-8にCRAC電流を記録するために使用される手続きから導入されました。
プロトコル
1。一休みするヒトTリンパ球の調製
- RosetteSepヒトT細胞の濃縮カクテルとRosetteSep密度培地を用いて、製造元の指示に従って、人間の血液サンプルからT細胞を精製する。結果として得られる細胞集団は95％CD3 +安静時のT細胞が含まれている必要があります。私たちは、カリフォルニア大学デービス校の内部審査委員会によって承認されたプロトコールに従って健康なボランティアから採取した末梢血サンプルからのヒトTリンパ球を精製する。
- 単離後、10％ウシ胎児血清、2％グルタミン- I、1％RPMI 1640を添加した、グルタミンおよびHEPESを含むRPMI - 1640培地を含む細胞培養培地中で0.5 × 10 6細胞/ mLの密度で休んでT細胞を再懸濁ビタミンソリューション、1％RPMI 1640アミノ酸液、1％ピルビン酸ナトリウム、および0.03％β-メルカプトエタノール。
- 場所細胞の細胞培養フラスコにサスペンション、°加湿インキュベーター中、5％CO 2で、最大24時間の前に実験に、37で維持する。
2。記録チャンバーの準備
- 以下は、録音室を準備するために必要とされる。）シリコンO -リング、b）のラウンドは、25mmの製造元の指示に従って調製Sylgard184を混ぜ、70％エタノールおよび蒸留H ....
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ディスカッション
これらの細胞中の内因性CRAC電流振幅が小さいセルサイズ（安静時のヒトT細胞の直径は5〜8μmの範囲にある）のために小さいため、ヒトT細胞の休止のCRAC電流の電気生理学的研究は困難な作業です。ここで、我々は確実に末梢血単核細胞から単離されたヒトTリンパ球を休んでCRAC電流を記録するためにステップバイステップの手順を示します。この技術は、私たちはより良い正常および病的な免疫細胞応答の性質を理解するために休止期T細胞のCRACチャネルの生理機能と機能発現を調べることができます。このプロトコルを使用して、一つはそのような活性化ヒトT細胞、単球、およびマクロファージのような他の免疫細胞にだけでなく、ヒトT細胞を休息にCRAC電流を測定することができます。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
私たちは、施設やイオンチャネルの研究のための優れた環境をご提供するための生理学と膜生物学、カリフォルニア大学デービス校の学科に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| RosetteSepヒトT細胞濃縮カクテル | 幹細胞技術 | 15061 | |
| RosetteSep密度勾配培地 | 幹細胞技術 | 15705 | |
| グルタミン/HEPES含有RPMI 1640培地 | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| 胎児牛血清 | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100倍濃縮溶液) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 ビタミン溶液 (100倍濃度) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640アミノ酸溶液 (50倍濃縮) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| ピルビン酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-メルカプト–エタノール | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| イノシトール三リン酸 | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| ポリ-L-リシン臭化水素酸塩 | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| 塩化ランタン | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| タプシガルギン | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 シリコンエラストマーキット | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 半導体保護コーティング | Dow Corning | ||
| 63-500シリーズ 高性能除振光学定盤 | テクニカル・マニュファクチャリング社 | 63-540 | |
| ヘッドステージ付きEPC 10パッチクランプアンプ | HEKA Instruments | ||
| マイクロマニピュレーター | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| 40倍油浸対物レンズを備えたOlympus 1X71倒立顕微鏡 | オリンパス株式会社 | 1X71 | |
| Windowsコンピュータ | Dell | ||
| Pulseソフトウェア | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific グラフ作成および解析ソフトウェア | OriginLab | ||
| パッチピペットプラー | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| フィラメント付きホウケイ酸ガラス（外径：1.5mm、内径：1.10mm） | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| ナラシゲ’Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| シリコンOリング | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| カバーガラス 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
参考文献
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
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再版と許可
