ここでは、女性の黒い未亡人のクモの腹部から、絹を生産腺を除去する効率的な戦略について説明します。この手順では、高度に精製されたファッションの7つの別のシルク生産腺、クモの糸生産と繊維集合体を研究する研究者のための重要なプロセスの迅速な分離が可能になります。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
ブラックウィドウスパイダーシルクを生産腺の顕微解剖
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
現代のスパイダーは、子孫の1,2の開発の運動、餌捕獲と保護を含む生物学的機能の広い範囲で高性能な絹繊維をスピン。スパイダーは、多様な機械的性質を持っているいくつかの異なるファイバータイプを紡糸して、これらのタスクを完了する。繊維の種類のそのような専門化は、小さなbiofactoriesとして機能する別のシルク生産腺、の進化を通じて発生しています。これらbiofactoriesの製造と繊維の生産のための絹タンパク質を大量に保管してください。生化学的な一連の複雑なイベントを通じ、これらの絹タンパク質は、押し出し時に固体材料に液体から変換されます。
機械的な研究は、クモの糸は、高張力鋼3より強いことが実証されている。クモの糸糸の構造と機能の関係を理解するために分析は、クモの糸は、主としてそれらのタンパク質配列4内のブロックの繰り返しを持つタンパク質、またはフィブロイン、から成ることが明らかになっている。信じられないほどの引張強さとクモの糸の拡張性に貢献する共通の分子の署名は、翻訳絹のcDNAの解析によって解明されています。クモ絹の特別な材料特性を考えると、世界中の研究所では、商業用、軍事および産業用アプリケーションのための合成絹の繊維を製造する紡糸プロセスを理解し、模倣するために争って。研究室で人工的なクモの糸を紡績する主な課題の一つは、シルク生産腺からの繊維の押出し時に発生する生化学的プロセスの完全な理解を伴います。
ここでは、7種類のシルク生産のメジャーとマイナーampullate腺を含むcobweavingクロゴケグモ、から腺を5,6、小管状の[合成の卵のケースのシルク] [ドラグラインと足場絹を製造している] 7の単離のための方法を提示、8、鞭毛状の[COB -織工の未知の機能]、集計[接着剤の糸を作る]、房状の[合成の獲物のラッピングと卵のケーススレッド] 9と梨状10 [アタッチメントディスクの絹を作り出す]。このアプローチは、二酸化炭素ガス、腹部から頭胸部のその後の分離、およびシルク生産腺を得るために腹部のマイクロダイセクションでクモを麻酔に基づいています。別のシルク生産腺の分離に続いて、これらの組織は、質量分析（MSまたはMS / MS）分析を識別するために、北部、およびウェスタンブロット法、定量的リアルタイムPCRを含む別個の生化学的解析、のために異なる高分子を取得するために使用することができます新しい絹タンパク質配列、絹のアセンブリの経路に関与する、または細胞培養または組織学的実験のために無傷の組織を使用するタンパク質の検索。
プロトコル
1。腹部のスパイダーと分離して麻酔
- プラスチック（図1A）を敷いた段ボール箱にガラスの瓶から蜘蛛を転送します。我々は一般的にwoodpiles、ガレージや茂みからスパイダーを収集し、ガラス容器の実験室でそれらを収容する。スパイダーは、プラスチックライニングを登っことができないので、麻酔の目的で小さな瓶にガラスの瓶やコーヒーが缶fromスパイダーを転送するために効率的な方法を提供する。この時点でクモを処理する際に、安全のためにラテックス手袋や園芸用手袋の2つのペアを着用してください。
- クモは、プラスチックと並ぶボックスになっている間は、その裏面からクモに近づくとプラスチック培養瓶にクモのスライドをしましょう。スパイダーは、バイアルに入った後、すぐに（図1B）上からプラグインを置きます。我々は、約101.6ミリメートルX 31.75ミリメートル（L x奥行）であるバイアルを使用することをお勧めします。これは、麻酔の手順に必要な炭酸ガスの量を最小限に抑えます。
- 10分（図1C）のために平方インチあたり5〜10ポンドで炭酸ガスを導入することでクモを麻酔。ガスのこの量は、その麻酔後すぐにステップ1.4から1.5に進む必要があります、約5分間スパイダーをノックアウトされます。
- 小さな解剖皿に麻酔スパイダーを置き、クモ背側を上（赤い砂時計が下向き）の位置に鉗子を使用する。
- スパイダー（図1D）の残りの部分から腹部を解放するために（頭胸部と腹部をつな....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
クロゴケグモから絹糸を生産腺のマイクロダイセクションのための私たちの方法論は、高度に精製されたシルク生産腺を得るために効果的な手段を提供しています。解剖は、7つの別の完全なセットシルク生産cobweaversから腺をもたらして、1.5〜3時間で完了することができます。高度に精製されたシルク腺のサンプルを得ることが選択的に別の腺で発現する遺伝子のmRNAレベルの分析、研究者の新たなシルクや質量分析法を用いて腺管腔内容物内に格納されているシャペロンタンパク質の同定を含む生化学的研究の広い範囲を、実行する機能を可能に、と絹の生産のメカニズムを研究するためにin vitroで特定の腺の培養。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、ブラックウィドウのクモの糸の分子特性と題されたNSF RUIグラントMCB - 0950372によってサポートされていました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 塩化ナトリウム | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 0.1 M水溶液 |
| ジエチルピロカルボネート | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0.1% v/v |
| クエン酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 0.015 M水溶液 |
| 解剖顕微鏡 | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| デジタル顕微鏡カメラ | Leica Microsystems | DFC320 | ソフトウェア - Leica Application Suite v2.8.1 |
| バナス鋏 | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| ステンレス製ピンセット | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| 昆虫ピン | Indigo Instruments | 33414-2 | 昆虫ピン #2 |
| 小型または大型解剖皿 | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 直径 52 mm x 高さ 18 mm (Sylgard深さ 約6mm) または 93 mm x 22 mm |
| Drosophila 飼育瓶 | Carolina Biological | FR-17-3076 | サイズは 直径 31.75 mm x 101.6 mm |
参考文献
- Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
