脊髄損傷を研究するための新生児ラットの皮質脊髄ニューロンへの標的ウイルス送達

要約

出典: Smit, RD, et al.脳と脊椎の併用手術を用いた二重ウイルスベクターによる新生ラットの皮質脊髄路の標的化J. Vis. 経験。(2021年)

このビデオは、新生ラットの皮質脊髄ニューロンへのウイルスベクターの標的送達を示しています。このプロトコルは、順行性および逆行性ウイルス注射を使用した正確な遺伝子発現を可能にし、脊髄損傷後の神経再生と可塑性に関する研究を促進します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 軸索終末を標的とする脊髄への直接注射

1. ガラス注射針の先端を使用して、脊髄動脈を特定して脊髄の正中線を近似します。ただし、脊髄動脈が著しく中心から外れているか、何らかの形でずれている場合は、C2棘突起の位置を使用して正中線を近似し、これを脊椎の長さに沿って外挿します。
   注:パラフィルムに~5 μLをピペッティングしてウイルスをインジェクターにロードし、先端がウイルス液滴の上に置かれるように針を配置します。
2. 特定したら、針をおおよその正中線の C5 層のすぐ後ろに配置し、これを基準点として使用します。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、針を右に横方向に0.3mm動かします。脊髄の表面に触れるまで針を下げます。この深さから、針を脊髄に0.6 mm突き刺します。必要に応じて、脊髄に穴を開けるまで針を突き刺し続けます。次に、針を適切な深さまで引っ込めるか下げます。
3. 1 μLのレトロアデノ随伴ウイルス2-scCreを250 nL/分で注入します。注射が完了したら、ウイルスが脊髄に拡散するまで2分間待ってから、ゆっくりと針を引き抜きます。脊椎窓内のさらに 2 つの部位 (1 つは中点、最後の T1 椎弓板のすぐ前) で、同じ横方向座標と深さ座標を使用して注射を繰り返します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フレキシブルニードルアタッチメント	プレシジョンインスツルメンツ	MF34G-5	針の洗浄とガラス針への赤いオイルの充填用。
ガラス毛細管世界	精密機器	4878	っ張られたガラス針用 - ナノリットルのインジェクター用に設計されるべきである。
バーニアスケール付きマイクロマニピュレーター	Kanetec	N/A	手術中の正確なターゲティング用。
ラボ標準位置定位固定装置	Stoelting	51600	新生児定位固定装置ホルダーを所定の位置
マウスおよび新生児アダプター付きラボ標準		51615	頭蓋手術および脊椎注射中の新生児頭蓋骨固定用
ライトおよびバーニアスケールの顕微鏡	Leitz Wetzlar	N/A	引っ張られたガラス毛細管の機能的なガラス針への面取りを視覚化および測定するために使用されます。
マイクロシリンジポンプコントローラー	World Precision Instruments	62403	注入速度を制御します。
ナノリットル 2000 ポンプ ヘッド インジェクター	ワールド プレシジョン インスツルメンツ	500150	制御された方法でウイルスをロードして注入します。
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre プラスミド
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth's lab through Addgene		DREADD プラスミド
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	動物モデルの注射を可能にするために、1mLおよび10mLシリンジで使用します。
ラット歯鉗子	Roboz	RS-5152	棘突起を把持するため。
滅菌生理食塩水	クスターヘルスケアコーポレーション	281324	血液の浄化、および手術後の体液の補充に使用します。
手術用手袋	N/A	N/A	外科医が手術中に無菌野を維持するために使用します。
外科用加熱パッド	N/A	N/A	手術中の動物モデルの体温を維持するため。
手術用顕微鏡	N/A	N/A	手術創の視覚化を強化します。

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