覚醒したげっ歯類の脳への治療薬のマイクロインジェクションベースの送達

要約

出典: ポーランド、R. et al.動機付け行動の分子基質を研究するためのげっ歯類脳マイクロインジェクション。J. Vis. 経験。(2015年)

このビデオでは、シリンジとマイクロインジェクターチューブで構成される水で満たされたマイクロインジェクションセットアップを使用して、正確な薬物送達を行います。事前に埋め込まれたガイドカニューレを備えたラットは、標的を絞った脳顕微注射を受け、組織損傷を最小限に抑えながら覚醒した動物に治療薬を正確に投与できるようにします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マイクロインジェクションシリンジとマイクロインジェクターの注射用準備:
   1. 各気密マイクロインジェクションシリンジをマイクロインジェクションポンプのラックにロックします。
   2. 気密シリンジの先端を小さな計量ボートに含まれる滅菌水に入れ、プランジャーをそっと羽ばたかせて内部ワイヤーを潤滑します。プランジャーをポンプのバックストップまで均等に引っ張って水を入れます。
   3. マイクロインジェクターに接続されているPE20チューブを、滅菌水で満たされた1mlシリンジに取り付けられた26G(茶色のハブ)針にスライドさせます。マイクロインジェクターを通して滅菌水をスプレーし、スプレーパターンと距離を検査します。
      注:水はマイクロインジェクターの先端から非常に遠くまでまっすぐにスプレーする必要があります。ストリームが真っ直ぐでない場合、射出位置は正しくありません。
   4. 滅菌したマイクロインジェクターを無菌フィールドに置きます。
   5. チューブを針からスライドさせて外し、マイクロインジェクターチューブを直立させて水が滴り落ちないようにすると同時に、針によって損傷した領域の下のチューブを切断します。
   6. マイクロインジェクションシリンジプランジャーを少し前に押して針の端に液滴を作り、水で満たされたPE20チューブ(マイクロインジェクターに接続されている)を針にスライドさせます。
      注:これにより、マイクロインジェクターの先端に形成される可能性のある詰まりを取り除く可能性のある適切な背圧を可能にする液体間接続が作成されます。
   7. プランジャーを完全に前方に押してサンプルの装填を準備し、マイクロインジェクターに微量エタノールが残らないようにします。
   8. マイクロインジェクターの先端に形成された水滴を清潔なラボ用ワイプに複数回触れて、セットアップに漏れがないか確認します。
2. 注意: ラボワイプに触れると、濡れた場所が 1 つだけ形成されます。さらに滴が多い場合は、システムに漏れがあります。
3. 瞬間接着剤の塗布を制御し、PE20チューブを接続部から取り外すときはいつでも鋭利なハサミまたはカミソリの刃でPE20チューブをトリミングすることで、漏れを防ぎます。
4. シリンジプランジャーを0.2μl引き戻します。PE20チューブ/マイクロインジェクター内の滅菌水と注入する溶液の間に気泡を作ります。
5. 注:この気泡は、注入液の希釈や水の汚染を防ぎ、注入中に移動するため、注入プロセスの監視を可能にします。単一の固体の気泡を生成する必要があります。
6. マイクロインジェクターを注入する試薬に入れ、シリンジプランジャーをゆっくりとバックストップまで引きます。
7. 注射用の動物の準備:
8. ラットの胸を実験者の胸に当てます。70%エタノール(v / v)に浸した綿アプリケーターでカニューレの周囲をきれいにします。
9. 注意: 適切に取り扱えば、マウスはカップ状の手で優しく拘束できます。それ以外の場合は、首筋が必要になる場合があります。
10. 小さな鉗子を使用して閉鎖器を取り外し、70%エタノール(v / v)を入れた計量ボートに入れます。
11. 注射の実行:
12. 充填されたマイクロインジェクターをカニューレに入れます。マイクロインジェクションポンプのスタートを押して、気泡の動きを監視します。
13. 注意: マイクロインジェクターが持ち上がらないように、軽い圧力を加える必要がある場合があります。気泡は均一に前進し、マイクロインジェクターに完全に入るはずです。
14. 注射が完了し、注射後の拡散期間が経過したら、カニューレからマイクロインジェクターを取り外し、オブチュレーターを交換します。
15. 注:一般的な注射後の拡散時間は、薬理学的試薬の場合は2〜4分、ウイルスの場合は2〜10分です。注入後の期間中にマイクロインジェクターを挿入したままにしておくと、注射液が組織に拡散するのではなく、カニューレに逆流するのを防ぎます。エタノールを充填した計量ボートの側面にオブチュレーターを配置して、カニューレに再挿入する前にエタノールを排出します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カニューレチューブ	Amazon Supply/ 小型部品	HTXX-26T-60	26 ゲージ、ハイポチューブ S/S 316-TW 26GA
オブチュレーター	Amazon Supply/ 小型部品	GWXX-0080-30-05	33 ゲージ、ワイヤー S/S 316LVM 0.008 IN
マイクロインジェクター ワイヤー	MicroGroup	33RW 304	33ゲージ
グルー	タイト	3924AC	液体、非ゲル、オートクレーブ滅菌可能
インジェクタープラスチックチューブベ	クトンディクソン	427406	PE20
重量止血器ワールド	プレシジョンインスツルメンツ	501241-G
定規	フィッシャー09-016		150mm
鉗子	Stoelting	52100-77	Dumont、Dumostar
ロータリー ツール	Dremmel	285	2 速
カットオフ ディスク	McMaster Carr	3602	15/16" x 0.025"
マイクロインジェクション ポンプ	Harvard Apparatus	PhD 2000
1 ul ガラス シリンジ	ハミルトン	7001KH	ニードル スタイル: 25s/2.75"/3
コットン チップ アプリケーター	フィッシャー	23-400-101
ラボ ワイプ	キムワイプ	34133
オペラント ソフトウェア	コールボーン	グラフィック ステート
オペラント チャンバーズ	コールボルン	ハビステスト

スーパーロックマイクロ中