動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1.げっ歯類の順応と食物制限実験
- 開始時に生後3か月の成体Wistarラットを使用します。層流ユニットとエアフィルターを備えたケージに、温度と湿度が制御された米国実験動物ケア認定協会(AAALAC)認定の動物ケア施設で、逆の12時間の明暗サイクル(0600時に消灯)でネズミを単独で飼育します。
- 体重が約380〜400 gになるまで、水と標準的なげっ歯類の食事を自由に与えます。その後、ラットを食物制限し、実験セッション中に自由摂食体重の85〜90%に維持して、メタンフェタミンに対する反応の獲得と維持を促進します。
- 体重を記録し、毎日の食物配分を調整するために、到着から実験セッション中、毎日ホームケージルームでげっ歯類を扱います。
- 目標体重が達成されたら、各ラットに慢性留置頸静脈カテーテルと頭蓋内刺激電極を外科的に移植する準備
をします。
2. 頸静脈カテーテル法
- カテーテルの準備
- 内径 0.012 x 0.025' の長さ 13 cm のシラスティック チューブを準備し、追加のシリコン チューブと電気焼灼を使用してチューブの一端から 4 cm のシリコン ボールを作成し、自然乾燥させます。
- チューブのもう一方の端を柑橘類由来のリモネンベースの溶媒に数分間浸し、膨張させます。拡張チューブを直角に曲げたステンレス鋼のガイドカニューレに接続します。
- ステンレス製ガイドカニューレの曲げたベースを、歯科用アクリルセメントを使用して1インチ四方の生体適合性メッシュに固定します。
- カテーテルの内側と外側をエタノールと蒸留水で洗い流します。チューブから空気を注入して、残留液滴を除去します。一晩乾燥させます(O / N)。
- 無菌技術
無- 菌手術技術を使用して、専用の動物手術室ですべての手術を行います。オートクレーブを使用して器具やインプラントを滅菌し、滅菌タオルで覆われた手術台(OR)に防水紙を敷いて滅菌エリアを準備します。
- 処置中は滅菌手袋を着用し、すべての器具、インプラント、手術用ガーゼを無菌領域に置いてください。複数の手術を行う場合は、アルコール綿棒で各器具を拭き、その後、手術の合間にビーズ滅菌器で 20 秒
間拭きます。- Anesthesia
- ラットをアトロピン(硫酸塩)(0.04 mg / kg、sq.)で前処理し、続いてペントバルビタール(20〜50 mg / kg、ip)で前処理して麻酔を達成します。
- 滅菌ペニシリンGプロカイン懸濁液(75,000単位、筋肉内[i.m.])と鎮痛剤(カルプロフェン、5〜10 mg / kg、scまたはケトプロフェン、2〜5 mg / kg、皮下)を手術直前に動物に注射して、周術期の感染症と痛みをそれぞれ軽減します。
- 動物に適度なつま先をつまんで適切な麻酔を確認し、反応がない場合は続行します。両目にアイ潤滑剤を塗ります。
- 手術部位の準備
肩- 甲骨を結ぶ線のすぐ後ろにあるラットの背中に2 x 2 cmの背側パッチを剃ります。顎の骨と胸骨の間の右首領域に1 x 1 cmの腹側パッチを剃ります。
- 剃った部分をアルコールパッドで拭き、次にベタジン溶液で拭きます。ラットを滅菌タオルの上に置き、ベタジンを乾かしてから続行します。
- カテーテル移植
- 10枚刃のナイフを使用して、背中の肩甲骨中央部の肩甲骨を結ぶ線と平行に切開します。止血剤を使用して皮膚を下にある結合組織から分離し、メッシュカテーテルベースの平面を作成します。ラットを仰向けにする前に、滅菌生理食塩水でその領域を灌漑し、滅菌ガーゼで覆います。
- 10枚刃のナイフを使用して、右顎の骨と胸骨の間に斜めに切開します。止血剤を使用して皮膚を下にある結合組織から分離し、頸静脈を見つけます。
注:頸静脈は白/銀色で光沢があり、雌よりも雄のラットの方が大きいです。 - 静脈の下にヘラを置き、露出した静脈の上部(近位部分)に4-0シルク縫合糸をそっと結び、静脈を首に押し戻します。
- 結合組織を分離して、首の皮膚下、筋肉の上に表面のポケットを作成します。滅菌されたトロカールを首の切開部から肩甲骨中央切開部まで、腕の後ろから上向きにトンネルを掘り下げて押し込みます。硬いガイドワイヤーを首の端からトロカールを通して遠位カテーテルに挿入して、カテーテルを背中から首まで通します。ガイドワイヤーを首の切開部まで引き戻すと、取り付けられた遠位カテーテルがそれに続きます。
- 以前に配置した近位縫合糸を引き上げて、スパチュラ上で右頸静脈を分離します。ボールハサミを使用して、静脈の上部に小さな部分的な切り込みを入れます。
- 湾曲した鉗子を静脈切開部に挿入して開きます。鉗子を離して所定の位置に保ち、鉗子の先端の間にカテーテルの先端を通し、静脈に約2〜3 cm通し、そこで右心房の外側で終了します。
遠- 位静脈の周りに 4-0 シルク縫合糸を結んでカテーテルを固定します。近位縫合糸と遠位縫合糸を「ボックス」結び目で結び、安定性を高めます。
- ヘパリン化滅菌生理食塩水でカテーテルを洗い流し、血液を採取して移植が成功したことを確認します。結び目の1〜2 mm上の縫合糸をトリミングし、残りの近位カテーテルを首の皮膚の下に押し込みます。選択した適切な縫合糸/方法で閉じます。非吸収性縫合糸またはステープルを使用する場合は、全身麻酔下で10〜14日以内に除去する必要があります。滅菌綿先アプリケーターを使用して、切開部を抗生物質軟膏で覆います。
- メッシュベースの反対側の 2 つの角に吸収性縫合糸を使用して、遠位カテーテル/ガイドカニューレ/メッシュ アセンブリを皮下背中組織に固定します。中断された非反転吸収性縫合糸を使用して、ガイドカニューレの周りの背面切開部を閉じます。滅菌コットンチップアプリケーターを使用して、切開部を抗生物質軟膏で覆います。
- 術後ケア
- 3 ml シリンジを使用してヘパリン化 0.9% 滅菌生理食塩水でカテーテルを洗い流し、目詰まりを防ぐために閉鎖装置をガイド カニューレに挿入します。
- 各ラットのカテーテルを毎日洗い流して、開存性を維持します。
- 処置の直後に、ラットを手術室の温熱パッドの上に自宅のケージに入れ、意識と自発的な動きが戻るまで観察します。
- 回収されたラットをコロニールームに戻し、頭蓋内手術の前に5〜7日経過します。感染のチェックや動物の行動、外観、活動レベルの評価など、毎日体重を量り、取り扱い、全身状態を評価します。
- 問題が発生した場合は動物資源の獣医師に相談し、推奨される治療計画に従ってください。必要に応じて、周術期の痛みを治療するために、鎮痛剤(カルプロフェン、5〜10 mg / kg、皮下またはケトプロフェン、2〜5 mg / kg、皮下)を動物に注射します。
3. 頭蓋内電極留置
- 手術の準備
- セクション 2.2 で説明されているように、すべての手術を無菌状態で行ってください。
- Anesthesia
- 動物を麻酔導入チャンバーに入れ、気化器を5%に設定して、1,000〜2,000 ml /分でイソフルランガスをチャンバーに流します。
- 動物が横たわったら、チャンバーから取り出し、パッド入りの定位操作プラットフォームのノーズコーンに入れます。チャンバーからノーズコーンへのガスの流れを切り替え、気化器を2〜3%に設定してガスを作動させます。
必要に応じて- 気化器を調整して、安定した呼吸を維持し、手術中の刺激に反応しないようにします。
- 手術直前に滅菌ペニシリンGプロカイン懸濁液(75,000単位、i.m.)および鎮痛剤(ブプレノルフィン0.05〜0.5 mg / kg sc)をラットに注射して、周術期の感染症と痛みをそれぞれ軽減します。
- 動物に適度なつま先をつまんで適切な麻酔を確認し、反応がない場合は続行します。両目にアイ潤滑剤を塗ります。
- 手術部位の準備
- ラットの頭のてっぺんを剃り、ラットをイヤーバーに置き、処置中に頭を動かさないようにします。剃った部分をアルコールパッドで拭き、次にベタジン溶液で拭きます。続行する前に、ベタジンを乾燥させてください。
- 電極移植
- 鉗子で耳の間と少し前方の頭皮をつかみ、はさみを使って根元を横切ります。この操作では、頭蓋骨中央部の皮膚の 1.5 x 1 cm の領域が除去されます。
- 10枚刃を使用して頭蓋骨を通って頭蓋骨まで円周方向に切開し、湾曲した鉗子を使用して頭蓋周囲をこすり落として取り除きます。滅菌生理食塩水でその領域を洗浄し、余分な血液と生理食塩水をガーゼで軽くたたき、頭蓋骨を完全に乾かして、ブレグマを含む骨のランドマークがはっきりと見えるようにします。
- 両側手術の場合は、定位操作プラットフォームの両側にある各電極ホルダーに 1 つずつ、2 つのバイポーラ プラチナ イリジウム電極を取り付けます。最初の電極を前骨の上の ~1 mm の位置に移動し、デジタル ディスプレイに表示される前後 (AP) および内側外側 (ML) 位置の定位座標を書き留めます。電極が機能しなくなるため、電極の先端を頭蓋骨に実際に触れないでください。もう一方の電極についてもこの手順を繰り返します。
- 目的のターゲット構造に基づいて最終的な AP 座標と ML 座標を計算します。先端を頭蓋骨のすぐ上にして電極をこの位置に動かし、デジタルディスプレイ上の初期背腹側(DV)座標を取得します。目的のターゲット構造に基づいて最終的なDV深度を計算します。
注:側坐核シェルは、薬物完成行動への既知の関与を考慮して、ブレグマに対する次の定位座標を使用して、この例で標的にされました:APエントリ座標= [ブレグマでデジタル表示された座標] + 1.6MLエントリ座標= [ブレグマでデジタル表示された座標] ±右/左の場合は2.4DV深度= [頭蓋骨表面でデジタル表示された座標AP/ML エントリ時] - 8.5 頭- 蓋骨の表面にある各電極の投影された進入位置を油性マーカーでマークします。この操作中は、電極の先端をぶつけたり触れたりしないでください。
- 丸いボールダイヤモンドコーティングされたバリを使用して、各マークに1.4mmの穴を開けます。高速ドリルで頭蓋骨を突き抜けて頭蓋内金庫に突っ込まないように注意しよう。頭蓋骨がドリルで開けられたら、湾曲した鉗子を使用して硬膜に穴を開けます。
- 丸いボールダイヤモンドコーティングされたバリを使用して、頭蓋骨ネジを配置するための電極エントリーの後ろの追加の4か所に0.7mmの穴を開けます。手動ドライバーを使用して、0.8(直径)x 3.2(長さ)mmのステンレス鋼ネジを4本、正中線の両側に2本ずつ頭蓋骨に配置します。これらのネジは、今後数週間から数か月間頭蓋骨を所定の位置に保持する主要なインフラストラクチャであるため、長さの約半分まで頭蓋骨にしっかりと固定します。
- 電極ホルダーのZ座標を管理するノブを手動で回して、最初の電極をバロホールを通して脳に慎重に挿入し、計算されたDV深さまで挿入します。電極の先端への過度の損傷を防ぐために、毎秒約1/2回転に等しい速度でノブを回します。脳に入るときは、電極の先端が穴の骨の端に触れないようにしてください。
- 最初の電極を、バリと後部ネジの上に重ねた瞬間接着剤を使用して固定し、続いて歯科用セメントを固定します。このコンストラクトが完全に乾いたら、電極をホルダーから取り外します。2番目の電極の挿入とセメンティングプロセスを繰り返します。歯科用セメントを皮膚の端まで塗布しますが、頭蓋セメントキャップが長期的に緩むため、皮膚と重ならないようにしてください。
術- 後ケア
目- 詰まりを防ぐために、電極台座の上に 2 つのダスト キャップを置きます。
- 処置の直後に、ラットを手術室の温熱パッドの上に自宅のケージに入れ、意識と自発的な動きが戻るまで観察します。
- 回収したラットをコロニールームに戻し、実験を開始する前に5日かかります。感染のチェックや動物の行動、外観、活動レベルの評価など、ラットの全身状態を毎日計量し、取り扱い、評価します。
- 問題が発生した場合は動物資源の獣医師に相談し、推奨される治療計画に従ってください。必要に応じて、周術期の痛みを治療するために、動物に鎮痛剤(ブプレノルフィン0.05〜1 mg / kg sc)を注射します。頭蓋内出血は、非ステロイド性鎮痛薬(カルプロフェン、5〜10 mg / kg、皮下またはケトプロフェン、2〜5 mg / kg、皮下)を使用するとより一般的になる可能性があるため、頭蓋内手術にはブプレノルフィンを周術期に使用してください。
4. 操作装置
消
- 音エンクロージャ内に含まれるプラスチックおよびステンレス鋼のオペラント コンディショニング チャンバーを使用して、行動実験を実行します。
- 各筐体に換気とホワイトノイズを供給する排気ファンを装備して、異音を隠します。
- パソコンと行動ソフトウェアインターフェースシステムを使用して、手順をプログラムし、実験データを収集します。
- 一般的なセットアップ
- 各実験室に、チャンバーの片方の壁に取り付けられた2つの応答レバーを装備し、各レバーの上に刺激ライトを配置します。レバーの1つを「アクティブ」レバーに指定して、押したときにプログラムされた結果になるようにします。
- アクティブレスポンスレバーの真上にある刺激ライトをプログラムして、オペラントセッションのたびに点灯し、薬剤の入手可能性を示します。
- アクティブレバーに反応すると、メタンフェタミン (0.05 mg/kg/100 μl 0.9% NaCl 注入中) が 2.8 秒間注入され、反対側の壁のハウス ライトが 5 秒間点灯し、刺激ライトが 30 秒間消灯します。
- アクティブなレバーの応答をカウントしますが、30 秒のタイムアウト期間中にスケジュールされた結果は発生しません。完了するには、非アクティブなレバーの応答を記録しますが、スケジュールされた結果はないはずです。
5. 静脈内 (IV) メタンフェタミン自己投与手順
の
- 一般的な準備
- 行動アーティファクトを最小限に抑えるために、できるだけ迅速かつ落ち着いてラットをオペラント チャンバーにロードします。げっ歯類の背中のガイドカニューレと、オペラントチャンバーの上に吊り下げられた漏れ防止流体スイベルにステンレス鋼のスプリングリーシュを取り付けます。
ス- イベルから20ml薬物シリンジへの接続チューブの完全性を、消音エンクロージャの外側にあるモーター駆動ポンプで確認します。これを行うには、プラスチック接続チューブを金属製のスイベルチップと薬物注射器の針の先端に少なくとも1/4インチ押し、適度に引っ張っても滑り落ちないようにします。スイベルとリードのアセンブリを相殺して、動物の比較的自由な動きを可能にします。
- 月曜日から金曜日まで、毎日ほぼ同じ時間にオペラントセッションを実施します。
- Acquisition
- IVメタンフェタミン自己投与の迅速な取得を促進するために、ラットを毎日6時間のセッションで4〜5日間連続して実行します。
- これらのセッションは、固定比率のFR-1 + 30秒の強化スケジュールで実施し、その間、ラットはアクティブレバーを押すたびにIVメタンフェタミンを1回注入され、その後30秒のタイムアウトが続きます(例えば、いずれかのレバーを押しても合図や報酬の結果は発生しません)。
注:この最初の長期にわたる「簡単な」アクセスにより、げっ歯類の大多数は、次のレベル以下で重大な薬物摂取行動を獲得する結果になります1週間(図3)。
- Maintenance
- トレーニングの 2 週目は、月曜日から金曜日まで毎日 2 時間のセッションでラットを走らせて、IV メタンフェタミンの自己投与を維持および改良します。
強化- の固定比率FR-1 + 30秒のタイムアウトスケジュールでセッションを実施します。
- 各セッションにわたるメタンフェタミンの提示の総数が 3 回連続して 10% 未満の変化 (図 4) であり、最初の 30 分間の累積注入回数が次の 30 分間の累積注入回数よりも多い場合 (図 5) に、安定した激しい反応を文書化します。
注:この基準により、ラットはセッションの開始時に、単なるカジュアルな使用ではなく、中毒性のある行動19を示す薬物負荷パターンを発達させます。
- Post-Session
- 各セッションの最後に、げっ歯類の背中からリードを外します。血栓を防ぐために、800 IU のストレプトキナーゼを含む 0.9% 生理食塩水 0.1 ml でカテーテルを洗い流します。ラットをホームケージに戻す前に、目詰まりを防ぐために各ガイドカニューレに閉鎖器を挿入します。
- 実験の過程を通して、水曜日の各実験セッションの終了直後にカテーテルの開存性をテストします。
- カテーテルの開存性をテストするために、ヘパリン化静菌生理食塩水を含む 22 G 針付きの 3 cc シリンジを準備します。長さ4〜6インチのプラスチックチューブの一端を針に取り付け、もう一方の端を動物の背中のカテーテルカニューレアセンブリの金属ポストに取り付けます。
- 0.1〜0.2mlの生理食塩水を注入して流れがきれいになるようにしてから、シリンジプランジャーを引き戻します。カテーテルが特許を取得している場合は、簡単に洗い流し、チューブに見える血液を吸い戻す必要があります。プランジャーを解放し、さらに0.2mlを注入して、すべての血液をカテーテルを通して洗い流します。
- 血液を採取できない場合は、3 ccのシリンジとチューブを金属製の支柱から取り外します。
速効性麻- 酔薬であるメトヘキシタールナトリウムを含む22 G針付きの1 ccシリンジを準備して、カテーテルの開存性をさらにテストします。長さ4〜6インチのプラスチックチューブの一端を針に取り付け、もう一方の端を動物の背中のカテーテルカニューレアセンブリの金属ポストに取り付けます。
- 1.5 mgを注入し、動物の背中の金属ポストから1 ccの注射器とチューブをすばやく取り外します。ヘパリン化静菌生理食塩水で満たされた3ccシリンジを再接続し、0.1〜0.2mlを注入します。動物が3秒以内に筋緊張を失った場合、カテーテルは開存しており、機能しています。
- メタンフェタミンに対する副作用、メタンフェタミンの自己投与の取得の失敗、およびラットの抽出の困難に対処する落とし穴のセクションについては、補足ファイル「一般的な落とし穴」を参照してください。
6.脳刺激装置
- 10〜12個のプレキシガラスボックス(12 x 18 x 18インチ)(幅x高さx奥行き)を使用して、DBS実験を実行します。ネズミが互いに見たり相互作用したりしないように、箱の裏側と側面を覆う硬い不透明な紙で各箱の外側を覆います。検査官が刺激セッション中に動物を見ることができるように、透明なフロントパネルを覆っていないままにしてください。
- 箱の上部を半透パネルで覆い、空気の流れを通しながらネズミが逃げるのを防ぎます。このパネルを使用して、各ボックスの上にある整流子を支え、げっ歯類の頭のキャップと刺激システムの間の電気的接続を容易にします。
- DBS実験では、複数の動物に同時に一定の電流を供給できる刺激システムを使用します。ユーザーがプログラム可能なデジタル信号プロセッサ/通信インターフェース、刺激装置、刺激装置バッテリーパック、チャンネルスプリッタボックス、および付属のソフトウェア(材料シートを参照)で構成されるシステムを使用してください。
- カスタム長のケーブルを使用して、刺激装置のチャネルポートを各整流子の上層電子台座に接続します。
注:必要な長さは、個々の研究室によって異なります。これらのケーブルは動物エリアの外側にあり、ステンレス鋼のスプリングで覆う必要はありません。 - ステンレス鋼のスプリングで覆われた16インチケーブルを使用して、整流子の下部電子台座をげっ歯類のヘッドキャップの埋め込み型電極台座に接続します。ヘッドキャップに大きな張力をかけずに、エンクロージャのあらゆる領域に自由に移動できるように、ケーブルの長さが十分であることを確認してください。
注: 通常、4本足で立ったときにラットの頭が置かれる位置で終わるケーブルで十分です。 - 脳刺激プログラミング
パ- ソコンとプログラミングソフトウェアを使用して、刺激パラメータ(波形、周波数、パルス幅、刺激間遅延、電流振幅など)をプログラムし、実験データを収集します。
- ビジュアルプログラミング言語を使用して、実験エンドポイントを満たすために各デバイスが実行する機能と、リアルタイムで表示するために保存および/または投影するデータを指定します。この特定のプロジェクトを実行するコマンドを図 1 に示します。
- 実験を開始する前に、ビジュアルコントロールパネル(図2)で希望の周波数、パルス幅、振幅を指定します。ラットにおける高周波刺激の典型的なパラメータは、臨床ヒト脳深部刺激で使用されるものと類似しています:130〜180 Hzの周波数、60〜90ミリ秒のパルス幅、および100〜250μAの電流振幅4,8-10。
注:げっ歯類では、霊長類に比べてサイズが小さいため、より低い電流が使用されます。
7. 脳深部刺激療法
- ラットを箱に積み込むには、整流子からヘッドキャップの各電極台座にステンレス鋼のスプリングケーブルを取り付けます。1,000 Hzの周波数で5μAの電流を2秒間流して、各電極のインピーダンスをテストします。
- インピーダンスが125KOhm以下の場合、電極は治療刺激を提供できるため、実験を続行します。インピーダンスが125kΩを超える場合は、電極の高い抵抗により電流が治療レベル以下のレベルまで切り捨てられる可能性があるため、動物を実験から除外することを検討してください。
- 慣れさせるためにラットを 1 回または 2 回の模擬セッションに実行し、その間、ラットは電極ケーブルに取り付けられますが、積極的な治療は受けません。模擬テストは、非特異的な行動への影響を排除します。各模擬セッションの直後に、IVメタンフェタミン自己投与の毎日2時間のセッションのためにラットをオペラントボックスに運びます。
- ラットを能動刺激コホートと偽刺激コホートの2つのグループに分散させ、ベースラインの薬物摂取量がグループ間で有意差がないようにします。
げ- っ歯類コホートに対して毎日 DBS セッションを 5 日間実行し、その間、グループの割り当てに応じて、積極的な脳電気刺激を受けるか、3 時間刺激を受けません。各DBSセッションの直後に、IVメタンフェタミン自己投与の毎日2時間のセッションのためにラットをオペラントボックスに輸送します。
- 各 DBS セッションの少なくとも一部では動物を注意深く観察し、刺激が動物の行動に明らかな変化を引き起こしていないことを確認してください。刺激中/刺激後に異常な行動が発生した場合は、これらの観察結果を文書化するように注意してください。注:著者らは、この記事で説明されている実験中に、著者らは、著しい行動の変化や食物/水摂取量の変化に気づいていない。
- 仮説に応じて、必要に応じて、DBS 処理の長さ、電気的パラメーター、および DBS セッションとオペラント セッションの間の時間を変更します。
