方法論記事
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2025年8月29日
出典: Palma-Tortosa, S., et.al.ヒト幹細胞移植と検証のためのex vivoモデルとしての成人ヒト皮質の器官型培養J. Vis. 経験。(2022年)
このビデオは、幹細胞由来の神経前駆細胞をヒト皮質組織スライスに移植する方法を示しています。この手順では、前駆細胞を基底膜マトリックスに単離して再懸濁し、続いてトランスウェルアセンブリ上に配置された皮質スライスに注射します。マトリックスの固化とニューロンの分化を可能にするためにインキュベーションした後、移植された組織はさらなる分析のために準備されます。
サンプル収集を含むすべての手順は、研究所の IRB ガイドラインに従って実行されています。
1. lt-NES細胞の増殖と分化
注:ヒト人工多能性幹細胞由来の長期自己複製神経上皮様幹細胞(lt-NES)細胞を生成し、構成プロモーター(GFP-lt-NES細胞)の下に緑色蛍光タンパク質(GFP)を運ぶレンチウイルスベクターで形質導入します。3 x 106細胞を含むバイアルは、使用するまで-150°Cで保存されます。
1. ストック溶液とメディアの準備
1.100 μgの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)-0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)で希釈して、ストック濃度を10 μg/mLにします。100 μLのアリコートを調製します。
2. 100 μg の上皮成長因子 (EGF) を 10 mL の PBS-0.1% BSA で希釈して、ストック濃度を 10 μg/mL にします。100 μLのアリコートを調製します。
3. アリコートあたり 100 μL の容量で 50x B27 サプリメントをアリコートします。
4. 10 mg のポリ-L-オルニチンを 100 mL の脱イオン水で希釈して、ストック濃度を 100 μg/mL にします。1mLのアリコートを作ります。
5. 1.20 mg/mLのマウスラミニンの30 μLアリコートを調製します。
6. 10 mLのトリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(0.25%)を90 mLのPBSで0.025%のストック濃度に希釈します。1 mLのアリコートを準備します。
7. 0.025 gのトリプシン阻害剤を50 mLのPBSで0.5 mg/mLのストック濃度に希釈します。1 mLのアリコートを準備します。
8. 10 μg の Wnt3a (翼のない型 MMTV 統合部位ファミリー メンバー 3A) を 1 mL の PBS-0.1% BSA で希釈して、ストック濃度を 10 μg/mL にします。BMP4(骨形態形成タンパク質4)を同じ方法で調製します。100 μLの容量にアリコートします。
9. 1 mg のシクロパミンを 2.5 mL のジメチルスルホキシド (DMSO) で最終濃度 400 μg/mL に希釈し、100 μL のアリコートを作ります。
10. 塩基性培地(表1)および分化定義培地(DDM、表2)を調製し、4°Cで最大2週間保存します。
2. 培養皿のコーティング
1.増殖または分化中にGFP-It-NES細胞を培養するために皿をプレコートするには、ポリ-L-オルニチンを脱イオン水で1:100に希釈し、5 mLの溶液をT25フラスコに加えます。室温(RT)で一晩インキュベートします。
2. ポリ-L-オルニチンでコーティングされたプレートを脱イオン水で1回、PBSで1回洗浄します。
3. 増殖中のGFP-It-NES細胞の場合、マウスラミニンをPBSで1:500に希釈し、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。分化中のGFP-It-NES細胞の場合、マウスラミニンをPBSで1:100に希釈し、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。
3. GFP-lt-NES セルの増殖
1.5 mL(洗浄用)と5 mL(播種用)の塩基性培地を2つの異なる15 mLチューブに入れて温めます。
2. GFP-lt-NES細胞の1バイアルを37°Cで急速に解凍し、洗浄チューブに移し、300 x g で5分間遠心分離します。
3. ペレットに触れずに培地を慎重に吸引し、予熱した塩基性培地1 mLに細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を、増殖因子(EGF(10 ng / mL)、bFGF(10 ng / mL)、およびB27(10 ng / mL)を添加した塩基性培地を含む播種チューブに移します。ポリ-L-オルニチン/ラミニンでコーティングされたT25フラスコに細胞を播種します。
4. 細胞に増殖因子を毎日与えます。媒体が黄色に変わったら交換してください。細胞を3日または4日ごとに継代します(100%コンフルエントに達してから1日後)。
4. 増殖と分化のためのGFP-lt-NES細胞の分割
1.フラスコあたり5 mLの塩基性培地(細胞を収集するため)と、細胞の再播種に必要な総量を予熱します。
注:継代は、細胞の増殖を維持するために1:3の希釈で行われ、15 mLの塩基性培地が必要で、分化を開始するには1:6の希釈で行われ、30 mLの塩基性培地が必要です。
2. 吸引によって細胞培養フラスコから培地を取り出し、予熱した0.025%トリプシン500 μLを加えます。RTで5〜10分間インキュベートします。細胞の剥離は、10倍の倍率で標準的な光学顕微鏡で確認できます。
3. 同量のトリプシン阻害剤(最終濃度0.5 mg/mL)を加え、続いて5 mLの温めた塩基性培地を加えます。上下にゆっくりとピペッティングして細胞を取り外して収集します。細胞を15 mLチューブに移し、300 x gで5分間遠心分離します。
4. 細胞を増殖状態に保つには、増殖因子を添加した新鮮な塩基性培地で1:3希釈で再プレーティングし、ステップ1.3.4を繰り返します。
5. GFP-lt-NES細胞の皮質分化<
p style='margin-left:40px;'>1.0日目に、増殖因子を添加した30 mLの塩基性培地に細胞(分化に使用)を再懸濁し、6つの分化コーティングされたT25フラスコ(1:6分割)にプレートします。2. 1日目に、培地の半分をDDMに変更し、増殖因子を濃度の半分で追加します。
3. 2日目に、培地を分化因子(BMP4(10 ng/mL)、Wnt3a(10 ng/mL)、およびシクロパミン(400 ng/mL)を添加したDDMに完全に変更します。
4. 4日目に、差別化要因のみを追加します。媒体が黄色に変わったら交換してください。
5. 6日目に、培地をBMP4とWnt3aを添加したDDMに変更します。シクロパミンはこのステップで除去されます。
6. 7日目に、ステップ1.4.2とステップ1.4.3で説明したようにセルをデタッチします。
2. GFP-lt-NES細胞の器官型hACtxスライスへの移植
注:成人ヒト皮質(hACtx)組織は、細胞移植の1週間前に培養する必要があります。移植手順を容易にするために、組織が浮くのを防ぐために、インサートの上部から 2 mL の hACtx 培地を取り除く必要があります。
1.皮質的にプライミングされたGFP-lt-NES細胞(ステップ1.5.6から)を、1 x 105細胞/ μLの濃度で低温純粋な基底膜マトリックス( 材料表を参照)に再懸濁し、溶液をより小さな滅菌チューブに移します。
注:移植手順中は、ゲルの固化を避けるために、すべての材料(ピペットチップ、チューブ、キャピラリーなど)を予冷する必要があります。使用前に、基底膜マトリックスゲルを氷上で30分間解凍します。
2.細胞懸濁液を、吸引のためにゴム製の乳首に接続された冷たいガラス毛細管に集めます。半乾燥組織スライスをさまざまな部位に刺すことにより、細胞懸濁液を小さな滴(各約1 μL)として注入します。
3. ゲルが固化するまで、37°Cで30分間インキュベートします。プレートをインキュベーターからフードに戻し、2 mLのhACtx培地をインサートの上部に慎重に加えて、組織を完全に沈めます。
4.培地を週に1回、新鮮なhACtx培地と交換します。
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表1:lt-NES細胞の増殖培地(塩基性培地)の組成。
| -グルタミンを含む 100 mL DMEM/F12 | 98.7 mL | ||
| N-2 サプリメント | 100x | 1:100 | 1 mL |
| グルコース |
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ヒト新皮質組織の管理と培養 6 | |||
| ウェルプレート | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex 足場 6 ウェルインサート | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 サプリメント (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | テキストでニューロン培地として参照 |
| ユニット 250 mL または 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| 鉗子 | 適切な | ||
| ゲンタマイシン (50mg/mL) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15750037 | |
| グルタマックスサプリメント(100倍) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 35050061 | でL-グルタミンとして参照されています |
| 乳首+ガラスピペット | 適切な< | ||
| 2-メルカプトエタノール 50 mM | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 31350010 | |
| 動物を含まない組換え EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 サプレムメント (50x) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 17504001 | |
| bFGF | ペプロテック | AF-100-18B | |
| ウシアルブミン画分 V (7.5% 溶液) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15260037 | |
| シクロパミン、V.カルシホルニカム | カルビオケム | # 239803 | |
| D (+) グルコース溶液 (45%) | シグマ | G8769 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | シグマ アルドリッチ | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 11320074 | |
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) | モフィッシャーサイエンティフィック | 14190-144 | カルシウムおよびマグネシウムラ |
| ミニンマウスプロテイン、天然 | モフィッシャーサイエンティフィ | 23017015 | |
| MEM非必須アミノ酸溶液(100倍) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11140050 | |
| N-2サプリメント(100倍) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 17502001 | |
| ポリ-L-オルニチン | メルク | P3655 | |
| 組換えヒトBMP-4 | R&Dシステム | 314-BP-010 | |
| 換えヒトWnt-3aタンパク質 | R&Dシステム | 5036-WN | |
| ピルビン酸ナトリウム(100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| 大豆トリプシン阻害剤、粉末 | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| 滅菌脱イオン水 | MilliQ | MilliQフィルターシステム | |
| トリプシンEDTA(0.25%) | グマ | T4049-500ML | |
| 細胞培養用機器 | |||
| 容量調節可能なピペット 10、100、200、1000 μL | エッペンドルフ | ||
| 基底膜マトリックス ESC認定(マトリゲル) | コーニング | CLS354277-1EA | |
| 遠心分離機 | ヘッティッヒ遠心分離機 | Rotina 420R | 5% CO2、37 °C |
| インキュベーター | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| 幹細胞切断ツール 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| 滅菌チューブ | Sarstedt | 各種 | |
| 滅菌使い捨てガラスパスツールピペット 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| 滅菌ピペットチップ 0.1-1000 μL | Biotix VWR | 各種 | |
| 滅菌血清ピペット 5、10、25、50 mL | Costar | 各種 | |
| T25 フラスコ Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 |
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