マウスモデルにおける安定した遺伝子組み換えのためのウイルスの定位注射

要約

出典: Porlan, E., et al.神経幹細胞の自律的および非自律的効果の解析のための成体マウスV‐SVZの細胞の安定的で効率的な遺伝子改変。J. Vis. 経験。(2016年)

このビデオは、マウスモデルにおけるウイルス保有治療遺伝子の定位固定注射による心室-脳室下ゾーン(V-SVZ)の神経幹細胞(NSC)の安定した遺伝子組み換えを示しています。ウイルスはNSCに入り、逆転写を起こし、ゲノムに組み込まれ、神経治療への応用のための安定した効率的な遺伝子組み換えを可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 側脳室 (LV) の心室-脳室下ゾーン (V-SVZ)/線条体境界への定位固定注射、または

1. LV<ol style='list-style-type:decimal;'>
2. 手術に必要なツール (メス、ドリル、小さなピンセット) を選択して滅菌します。
獣
3. 医の監督下でケタミンとメデトミジンの混合物を腹腔内(ip)注射することにより、6〜8週齢のマウスを麻酔します。各動物の体重を量り、マウス体重1kgあたり50〜75mgのケタミンと0.5〜1mgのメデトミジン(マウスあたり約100〜125μlのケタミン/メデトミジン作業溶液)をそれぞれ投与します。
4. つま先、尾、または耳をつまみ、動物が反応を示さないことを確認して、麻酔面を評価します。
5. マウスが麻酔されたら、術後の痛みを最小限に抑えるために、マウス体重1kgあたり0.4〜0.5mgの最終用量でブトルファノールを皮下注射します。
6. 耳の間の部分を剃り、ヨードポビドンや70%エタノールなどのヨードフォアを使用して皮膚を消毒します。滅菌コットンチップのアプリケーターを使用してクレンジングします。低体温症を悪化させる可能性があるため、動物を過度に濡らさないように注意してください。
7. 動物を定位固定フレームに腹臥位に置き、イヤーバーと装置の口蓋サポートを使用して頭を慎重に固定します。マウスを37°Cに設定した状態で加熱パッドを保ち、眼科用潤滑剤を目に塗布します。
メ
8. スで頭の皮膚を縦に1cmの切開をし、細いピンセットで皮膚をそっと引っ込めて頭蓋骨を露出させます。
滅
9. 菌の綿の先端のアプリケーターで骨の表面を注意深く洗浄します。露出した頭蓋骨から残っている組織を浄化します。
10. シリンジホルダーを使用して、滅菌したシリンジを定位装置に取り付けます。
11. シリンジ針の先端が、矢状(縦方向および内側)縫合糸が冠状縫合糸と垂直に交差する結合点であるブレグマに配置されるまで、x、y、およびz軸に沿ってシリンジホルダーを動かします(図1b)。背腹側(DV)軸の「ゼロ」位置がブレグマの頭蓋骨表面にあることを確認します。
12. シリンジをxおよびyの宛先座標に移動します(表1および図1bを参照)。
13. 後で注入部位に戻れるように、バーニアスケールでx、y、およびzの目的地座標に注釈を付けます。サージカルマーカーペンを使用して、x座標とy座標で骨に印を付けます。
14. シリンジを作業領域から離します。
15. 電気ドリルを使用して、脳を傷つけないように頭蓋骨に慎重に穴を開けます。軟膜表面に穴を開けると、脳表面を損傷する可能性があるため、ドリルを開けないでください。
16. シリンジに10⁶ TU/μl(形質導入単位/マイクロリットル)のウイルス溶液を1 μlロードします。先端の角度が10〜12°の33ゲージの鋭利な面取り針を使用してください。シリンジ針を脳表面に対して90°の角度で配置します。
17. シリンジを注射部位に戻し、先端が軟膜表面に触れるまで下に動かします。
18. 注射器で脳をDV軸のz座標まで貫通します。
19. 過剰な体液圧による脳組織への損傷を最小限に抑えるために、ウイルス懸濁液を0.2μl/分の速度でゆっくりと放出します。
20. ウイルス懸濁液の逆流を最小限に抑えるために5〜10分間待ってから、シリンジを非常にゆっくりと引っ込めます。

座標

注入領域<
	前後方 (AP)	中外側 (ML)	背腹 (DV)
SEZ/線条体境界	+0.6 mm	+1.2	mm-3.0 mm
脳室	-0.3 mm	+1.0	mm-2.6 mm

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表 1: 注射の定位座標。前後 (AP) 軸と中外側 (ML) 軸の場合、x 座標と y 座標は、前骨からの距離 (mm 単位) として与えられます。「-」は「後方に向かって」を示します。DV 座標の場合、「ゼロ」はブレグマ ポイントでの頭蓋骨の表面であり、DV 座標はこのポイントからの距離 (mm 単位) を示します。

結果

図1:手順のさまざまな部分の概略図。(a)LVを生成するための適切なプラスミドによるヒト胚性腎臓293T(HEK293T)細胞のトランスフェクションから、示された式を使用したフローサイトメトリーによるウイルス力価の決定まで、in vivo標識研究のためのLVの生成。プラスミドと遠心分離機ローターの名前が示されています。(bとc)左室の定位注射。「b」は、定位固定装置の一部であり、微細な測定に役立つデバイスであるバーニアスケールの例を示しています。例として、矢印は4.23cmを示しています。バーニアスケール...

材料

機器:

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バーニア定位固定装置	NeuroLab, Leica	39463001
シリンジホルダー	KD Scientific	KDS-311-CE
33ゲージシリンジ	ハミルトン	P/N 84851/00	85RN
電気ドリル	ファインサイエンスツール	98096
サーマルブランケット	Ufesa	AL5512/01	230-240 V、100-110 W、タイプ C-AL01
シェーバー	Jata	MP373N	モデル: 美しさ、3 V、300 mA、タイプ HT-03。
試薬:
メデトミジン	エステベ	ムター1mg	/mlの商業溶液。
ケタミン	メリアル	イマルジェーン 500	50 mg/ml メデ
トミジナ/ケタミン混合物			食塩水中で最終濃度 0.2 mg/ml 希釈のメデトミジンと最終濃度 15 mg/ml のケタミンの作業混合物を調製します。1kg体重あたり0.5〜1mgのメデトミジナおよび体重1kgあたり50〜75mgのケタミンの最終濃度を得るための容量を注射して麻酔として使用します
トルファノール	ザー	トルブゲシック	ストック溶液。生理食塩水中で1mg / mlの鎮痛として使用されます。
0.9%生理食塩水	Braun	13465412
サージカルマーカーペン	Staedler	313-9	パーマネントルモカラー
眼科用潤滑剤		Siccafluid	0.5 g/dosis、カルボマー 974P
ポビドンヨード	Betadine	694109.6	10% ポビドンヨード

<td colspan='4' rowspan='1'>ドの商業溶液 生理。10mg / mlのブファイ