胚マウスモデルにおける子宮内ナノインジェクションによる神経プレート細胞操作

要約

出典: Mangold, K., H el. al., 胚期 7.5 における子宮内ナノ注射 (NEPTUNE) によるマウス神経プレートのターゲティング。J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオは、胚マウスモデルにおける神経プレートターゲティングのための子宮内ナノ注入法を示しています。高力価レンチウイルス溶液を羊腔に注入し、そこで神経板細胞に統合し、神経発達研究や治療応用のための安定した遺伝子操作を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.注射

注:この手順で使用されるすべての器具は、手術前および各マウス間で滅菌されます。

1. 理想的な大きさの虫歯を持つ最初の女性を麻酔します。
2. 女性をテーブルの上に置き、固定します。
3. 角膜の乾燥を防ぐためにアイジェルを目に塗布し、鎮痛剤を皮下注射します。
   注:推奨される鎮痛薬:ブプレノルフィン(0.05〜0.1 mg / kg体重)またはフルニキシン(2.5 mg / kg)または地域の動物福祉規制に従って同様のもの。集学的周術期鎮痛は、注射された鎮痛薬とイソフルランによって維持されます。
4. 0.5 mg / mLのクロルヘキシジン溶液(または類似物)を浸した布で拭いて下腹部を無菌的に準備し、皮膚を乾燥させます。外科用ハサミを使用して、下腹部に1.5〜2.0 cmの垂直正中線の皮膚切開を行います。
   注:現地で承認された消毒ルーチンに従って手術領域を準備します。
5. 手術後の縫合を容易にするために、皮膚をそっと持ち上げ、切開点の周囲約1cmの下にある筋肉層から皮膚を解放します。
6. 筋肉層に1cmの垂直正中線切開を行います。
7. 鉗子のペアで、皮膚と筋肉層の片側を持ち上げ、もう一方のペアで子宮の角を探します。
   注:脱落膜はネックレスのビーズのように配置されていますが、腸は1つの長くて連続したチューブです(図1A)。
8. 鉗子で、腹部から両方の子宮角を慎重に引き抜きます。胚の間に組織を保持します。それらを直接絞らないでください(図1B)。
   注:子宮は子宮頸部で体に付着し、2つの卵巣/卵管は靭帯を介して付着しています。これらのアンカーポイントから子宮を引っ張ったり取り外したりしないでください。
9. 左右の胚の数を数えて書き留めます。
10. 卵巣から子宮頸部まで、または子宮頸部から卵巣までのいずれかに胚に番号を付けます。
    注:これは、注射された胚が胚の段階で収集される場合に特に重要です。
11. 湿らせた綿棒で、注射する最初の3つを除くすべての胚をそっと腹腔内に押し戻します。
12. PBS(リン酸緩衝生理食塩水)をペトリ皿のゴムに一滴置き、胚のすぐ上に保持します。
13. 閉じた鉗子を弾性の切開部に挿入し、鉗子を解放して弾性切開部を開き、液体が胚に落下します。
    注:これにより、胚の再水化が保証され、弾性膜が女性の濡れた皮膚に付着し、次のステップでのPBSの漏れが防止されます。
14. 3つの胚に対応する子宮の一部を鉗子でゴムを通して引っ張り、ペトリ皿を女性の腹部にそっと置きます。
15. 鉗子と湿った綿棒を使用して、子宮の位置とゴムを調整して、PBSの漏れを防ぐためにゴムが女性の皮膚に密閉されるようにします。
16. 4つの粘土足を使用して、ペトリ皿を腹部のすぐ上に固定して固定し、女性への圧力を軽減し、女性の呼吸と心拍に対する画像の感度
を軽減します。
17. モデリング粘土シリンダーを胚/子宮の右側に押し下げて子宮を固定します(図1C)。
    注:この向きの指示は、針が女性の左側にあり、女性の左子宮角の胚が露出していることを前提としています。羊膜 (AC) が針 (左角;図1D)または安定化粘土シリンダー(右角;図1E)。
18. 右子宮角から胚を注入するには、粘土シリンダーを胚の左側に置き(図1F)、加熱テーブルを180°回転させ(図1G)、正しい向きにします。代わりに針を動かすことができる場合は、関連するセットアップに合わせて調整します。
19. 胚と子宮がPBSで覆われるまで、PBSをペトリ皿に加えます。
20. 超音波プローブをPBSに下げ、マウス/手術台を調整して、最初の胚が超音波プローブと位置合わせされ、注射の記録を容易にします。
    注:「最初」は、卵巣から子宮頸部までの胚の番号付けを指します。
21. 3つの胚すべてをスキャンし、ACを検査します。注入量を次のように決定します:
    1. 超音波装置でACの直径を測定します。AC直径が≤0.2mmの場合は69nLを注入します。AC直径が>0.2 mmおよび≤0.29 mmの場合は、2 x 69 nL(= 138 nL)を注入します。AC>直径が0.29 mmの場合は、3 x 69 nL(= 207 nL)を注入します(図1H)。
       >注:以前の実験では、最大207 nLの注入量がE7.5で十分に許容されることが示されています。生存への影響を最小限に抑えた注射の成功は、AC の相対体積増加が 90% を超えない場合に達成されます。同腹仔またはマウス系統間のACサイズのばらつきは一般的であり、さらなる最適化が必要になる場合があります。
22. 射出コントローラで射出ボリュームを設定します。
23. 射出速度を 23 nL/s.
    注: 装置モデルが異なれば、射出力も異なる場合があります。
24. レールシステムのメインホイール(x面とz面、図1I)を使用して針をPBSに下げ、液体が針の先端に到達するまでナノインジェクターコントローラーの空を押します。
    注:針が詰まっている場合は、空を押すと詰まりを溶かしたり、詰まりを排出したりできます。
25. 針をPBSから持ち上げて、インジェクトを押します。おおよその希望の体積の一滴が排出されていることを確認します。
26. 針をPBSに下げ、マイクロマニピュレーターのY面ホイールでナノインジェクターを動かして、超音波プローブと胚に位置合わせします(図1J)。
    注:針先は、超音波画像に明るい点として表示されると完全に位置合わせされます(図1K、L)。針はマイクロマニピュレーターで3つの方向面すべてに動かすことができます。
27. 注入角度ホイールで針の角度を調整して、子宮壁に対してほぼ垂直な注入角度を確保します。マイクロマニピュレーターの注入ホイールを使用して、針を1回の動作でACに挿入します(図1J-M)。針先の明るさに注意してください。超音波画像から針の先端が消えた場合は、超音波プローブを前後に動かして、針の焦点を戻します。
    注:針がAC内に入ると、胚を傷つけることなく針の位置と焦点にわずかな変更を加えることができます(~0.3 mm以内の調整)。これ以上針の位置を調整しないでください。
Injectを
28. 押します(207 nLの場合、容量を69 nLに設定し、3回注入します)。 注射後、さらに5〜10秒待ってから、1回の穏やかな動きで針を引っ込めます。
29. ステージを次の胚に移動し、適切なACサイズがある場合は、他の2つの胚に対して手順1.22〜1.26を繰り返します。
30. マイクロマニピュレーターを使用して、超音波プローブと針をPBSから持ち上げます。損傷や怪我を避けるために、針をオペレーターから遠ざけてください。
31. 鉗子を使用して、1番目と2番目の胚をゴムにそっと押し込み、女性の腹部に戻します。3番目の胚に隣接する組織をそっとつかみ、子宮を弾性切開の上端に向かって引っ張ります。鉗子で4〜6番目の胚をそっと引き上げ、3番目の胚が腹部に再び入るようにします。
    注:このステップは、PBSを変更したり、ペトリ皿を取り外したりすることなく実行できます。
32. 最適なACを持つすべての胚が注入されるか、制限時間に達するまで、必要に応じて繰り返します。
33. 胚/子宮を女性の腹部にそっと押し戻します。
34. PBSを吸引し、ペトリ皿を取り出します。ウイルスを使用した場合は、感染性廃棄物として処理してください。
35. 筋肉層をビクリル(USP 6-0、針の長さ13 mm、3/8円)で単純な連続縫合糸または断続縫合糸で縫い合わせ、1〜2個のクリップで皮膚を閉じます( 材料表を参照)。
36. イソフルランポンプの電源を切ります。
37. サージカルテープを剥がし、女性を腹臥位(腹を下にして)に置き、40°Cの加熱プレート上の清潔なケージに入れます。
    注:女性は10分以内に意識を取り戻し、可動性が見込まれます。30分以内に手続きが完了するようにしてください。女性の遺伝的背景、年齢、体重は、麻酔に対する感受性に影響を与える可能性があります。手術中にマウスに、呼吸が遅い(呼吸が遅すぎるということは麻酔が深すぎることを意味します)または動き(麻酔が軽すぎる)の兆候がないか監視します。ブプレノルフィン (0.05-0.1 mg/kg 体重) またはフルニキシン (2.5 mg/kg) または同様のものは、地域の動物福祉規制に従って、必要に応じて最初の注射から 8 時間後に提供できます。
38. 別の女性を注射する場合は、最初の女性の覚醒を監視しながら手術部位を準備します。
    1. 手術器具を70%エタノールで拭いて残留血液や組織を取り除き、予熱したガラスビーズ滅菌器で10秒間滅菌します。綿棒を捨て、ティッシュペーパーを使用してください。ペトリ皿と粘土片をティッシュペーパーで拭いて乾かします。
39. すべての女性が注射されるまで、手順1.1〜1.35を繰り返します。
40. 針を空にして捨てます。
    1. 針にウイルスや注射液が残っている場合は、ナノインジェクターの[空]を押して、ティッシュペーパーの針の内容物を空にします。
    2. プランジャーが完全に格納されたことを示すコントローラーからビープ音が2回鳴るまで[Fill]を押して、金属製プランジャーを完全に格納します。
    3. コレットを緩め、金属プランジャーから針をスライドさせて外します。針を鋭利物廃棄物容器に捨てます。
41. BSL-2(バイオセーフティレベル2)ベンチを清掃します。
    1. ウイルスを使用した場合は、手術野全体に消毒剤をスプレーします( 材料表を参照)。15分後、消毒剤を拭き取り、70%エタノールで手術野全体を洗浄します。ウイルスを使用しない場合は、すべての表面を70%エタノールで洗浄します。
    2. 超音波プローブに残っているPBSを、乾いた柔らかい糸くずの出ないティッシュペーパーで拭き取ります。
42. 廃棄物はバイオセーフティガイドラインに従って廃棄してください。
43. 超音波装置、加熱テーブル、BSL2ベンチ、およびO₂電源の電源を切ります。

結果

図1:注射を成功させるための羊膜腔の最適なサイズと向き。(A)複数のE7.5脱落膜を持つ子宮角で、大腸(上)と比較して球の列(下)のような形をしています。(B)脱落膜の間の子宮組織(白い点線)をつかみます。脱落膜と発育中の胚はこの初期段階では壊れやすく、過度の外力で吸収されやすいため、剥落膜(白い矢じり)を鉗子で直接絞ることは避けてください。(C)仰臥位の女性で、PBS(リン酸緩衝...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL シリンジ	BD Bioscience	309628
27 G 針	BD Bioscience	300635
3.5 インチ キャピラリー	Drummond Scientific	3000203G/X	ニードルの引き込みに使用されました
70 MHz MSシリーズトランスデューサー	Visual Sonics	MS700
アクアソニッククリア超音波ジェル	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 マウス	Charles River, Germany	Crl:CD1(ICR)	メス:生後8週からオス:生後12週から
棒	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
ドレッシング鉗子 デリケートストレート 13 cm	Agnthos	08-032-130
EZ クリップ 9 mm	Angthos	59027	クリップ
アイリスハサミ、スーパーカット、ストレート、9 cm	Agnthos	307-336-090
イソフルオラン	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	スウェーデンの薬局から購入
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
メンブレン テープ	Visual Sonics	SA-11053
マイクロピペット プーラー	サッター インストゥルメント	P-97
モデリング Clay	Sense AB	10209
マウス ハンドリング テーブル	ビジュアル ソニックス	50249
Nanoject II オートインジェクターキット	モンド	3-000-205A
パラフィルム	ベミス	HS234526C
中央開口部付きペトリ皿 (低壁)Visual	Sonics	SA-11620
ペトリ皿、(ØxH): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	130000132037	剤
シリコンメンブレン	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250、ホットビーズ滅菌器	Angthos	31100
サージカルテープ (1.25 cm x 9.14 m)	Medicarrier	67034
Vevo コンパクトデュアル (Med. Air &; O2) 麻酔システム	Visual Sonics	VS-12055
Vevoイメージング ステーション 2	ビジュアル ソニックス	VS-11983
Vevo2100	ビジュアル ソニックス	VS-20047
ビクリル 6-0;C-3針、45cmパープルフィラメント	Agnthos	J384H

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