エレクトロポレーションによるげっ歯類坐骨神経のシュワン細胞への遺伝子導入

要約

出典: Ino, D. et al., エレクトロポレーションによるげっ歯類坐骨神経のシュワン細胞への in vivo 遺伝子導入。J. Vis. 経験。(2016年)

このビデオは、エレクトロポレーションを使用したげっ歯類坐骨神経のシュワン細胞へのin vivo遺伝子導入を示しています。プラスミドDNA-色素溶液が神経に注入され、電気パルスがDNAの侵入を促進します。その後、DNA は細胞のゲノムに組み込まれ、シュワン細胞での遺伝子導入の成功を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.プラスミドDNAの調製

1. 相補的DNA(cDNA)または短いヘアピンRNA(shRNA)配列を哺乳類細胞の発現プラスミドにサブクローニングすることにより、in vivoエレクトロポレーション用のDNAプラスミドを生成します。サイトメガロウイルス即時早期エンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーター融合(CAG)プロモーター駆動プラスミドを使用すると、強力で安定した発現が可能になります。CAGプロモーターの制御下でのshRNAの発現には、shRNAのサブクローニングにmir30ベースのshRNAカセットシステムを使用します。
2. メーカーの指示に従ってmaxi-prepキットでプラスミドDNAを精製し、HEPES緩衝生理食塩水(140 mM塩化ナトリウム、NaCl、0.75 mMリン酸水素二ナトリウム、Na₂HPO₄、25 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、pH 7.40))でDNAを再懸濁します。DNAの濃度を≥4μg/μlに調整します。
3. プラスミドDNA溶液を4 μg/μlの濃度に調製し、最小限の高速緑色色素(最終濃度0.01%)を加えて注射部位を標識します。複数のプラスミドの同時エレクトロポレーションが必要な場合は、プラスミドDNA溶液の総濃度を4 μg/μlに調整します。
   注:プラスミドDNAの最適な組成は、各プラスミドのトランスフェクション効率に従って決定する必要があります。

2. 手術器具および生理食塩水

1. オートクレーブ手術器具および 0.9% NaCl 溶液

の滅菌。

3. ガラスマイクロピペットの準備

ピ

1. ペットプーラーを使用してガラスピペットをプルします。ピペットの先端を直径30〜50μmにカットします。次のパラメータを使用します:熱、600;速度、50;タイム、75。

4.動物手術、DNA注入、およびエレクトロポレーション

注:このステップの概要を図1に示します。ラットの子犬の手順はここで説明されていますが、この方法は、同じ手順を使用するより成熟した動物にも適用できます。

1. 酸素流量を0.4 L / minに、イソフルラン濃度を4%(vol / vol)に調整することにより、動物が動けなくなるまで、誘導ボックス内のイソフルランでラットを麻酔します。適切な麻酔を確認するためにつま先をつまんでください。
2. ラットを両眼顕微鏡下で予熱したウォーマーの上に置き、フェイスマスクを通してイソフルランを連続的に投与して麻酔を維持します。酸素流量を0.2 L / minに、イソフルラン濃度を2%(vol / vol)に調整します。動物の目が開いている場合は、目の乾燥を防ぐために点眼薬を使用してください。
3. サージカルテープで脚を固定します。
4. ポビドンヨードで太ももの後部の皮膚をきれいにし、メスで切開します
   注:毛で覆われている場合は、手術部位を剃ります。
大
5. 腿四頭筋と大腿二頭筋の間に縫い針で開口部を作り、坐骨神経を露出させます。
6. 0.9%NaCl溶液で神経を濡らします。糸くずの出ない紙で余分な水分を吸収します。
7. ガラスマイクロピペットのベースをフレキシブルチューブに挿入し、適量のDNA溶液(少なくとも1マイクロリットル)を穏やかに吸引してマイクロピペットに充填します。
8. 針を使用して神経の遠位側をそっと引っ張って、露出した神経を持ち上げます。
   注:機械的ストレスを最小限に抑えるために、神経に張力を加えないでください。
9. ガラス製マイクロピペットを神経の遠位部位に挿入し、圧力を加えて(つまり、フレキシブルチューブの開いた端に息を吹き込むことによって)DNA溶液を注入します。神経が緑色に現れるまでDNA溶液を注入します(最大1μl)。マイクロピペットを頻繁に挿入すると神経を損傷する可能性があるため、マイクロピペットを2回以上挿入しないでください。
10. ピンセットタイプの白金電極を神経から約1〜2mm離して配置します。電極と神経の間の隙間を0.9%NaCl溶液で埋めます。
    注:神経への機械的ストレスを避けるために、電極で神経を保持しないでください。
11. 電極付きのエレクトロポレーターを使用して、注射部位に電気パルスを印加します。最初のパルスセットの後、電極を反転させ、別のパルスセットを印加します。次のパラメータを使用します:電圧、50 V;パルス持続時間、5ミリ秒;パルス間隔、100ミリ秒;パルス数、4回。
12. エレクトロポレーション部位を0.9%NaCl溶液で洗浄します。

5. エレクトロポレーション後:

1. シアノアクリレート接着剤で切開部を閉じます。
2. 接着剤を乾かした後、ポビドンヨードで傷をきれいにします。
3. 子犬をフェイスマスクから解放します。子犬が麻酔から完全に回復できるように、少なくとも1時間ウォーマーで子犬を温めます。

結果

図1:in vivoエレクトロポレーション法の概略図.まず、麻酔をかけたラットの坐骨神経が露出します。次に、プラスミドDNAを坐骨神経に注入します。第三に、鉗子状の電極を介して電気パルスが注射部位に送達されます。最後に、傷を接着剤で閉じます。この手順は、対側神経で繰り返すことができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GenopureプラスミドMaxiキット	Roche	03 143 422 001	プラスミドDNA精製キット
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	DNA注入用色素
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	ガラス毛細管
チューブ	Drummond	05-2000-00	マイクロインジェクション用吸引チューブ
モデル P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.	マイクロピペットプーラー
CUY21 シングルセル	BEX	エレクトロポレーター CUY21 シングルセル	パルス発生器
電気ウォーマー	KODEN	CAH-6A	手術中のウォーマー
ソフルオラン	ラン	1119701G1076	麻酔薬

吸引 イマイ