ラット褐色細胞腫12細胞における多孔質シリコン膜を用いた神経成長因子の持続送達

要約

出典: Rosenberg, M., et al.神経成長因子の担体としての多孔質シリコン膜の設計J. Vis. 経験。(2019)。

このビデオでは、PC12細胞の分化をサポートするために、神経成長因子(NGF)の徐放性に分解性ナノ構造多孔質シリコン(PSi)フィルムを使用する方法を示します。NGF は静電相互作用によってフィルムの細孔に吸着され、拡散と足場の劣化によって徐々に媒体中に放出されます。この制御された送達により、PC12 細胞の生存が促進され、長期間にわたる神経突起の成長と分岐が促進されます。

プロトコル

1. 酸化多孔質シリコン(PSiO₂)キャリアの作製

1. シリコン(Si)ウェーハ(片面研磨、<100>面研磨、ホウ素ドープp型、0.95 mΩ・cm)を、先端のダイヤモンドペンを使用して1.5cm×1.5cmサンプルに切断します。
2. Si試料を管状炉で400°Cで周囲空気中で2時間酸化します(加熱速度:25°C/分、自然冷却)。
3. Siサンプルをフッ化水素酸(HF)(48%)、二重蒸留水(ddH₂O)、およびエタノール(99.9%)(1:1:3 v / v / v)の溶液に5分間浸漬し、次にサンプルをエタノールで3回すすぎ、窒素流下で乾燥させます。
   注:HFはガラスを溶解するため、HF溶液を調製してプラスチック製品にのみ保管してください。
   注意: HFは腐食性の高い液体であるため、取り扱いには細心の注意が必要です。曝露の場合は、水で十分にすすぎ、患部をHF解毒剤ゲルで治療します。すぐに医師の診察を受けてください。
4. Siサンプルをポリテトラフルオロエチレンエッチングセルに取り付け、アルミホイルのストリップをバックコンタクトとして、プラチナコイルを対極として使用します。
5. HF水溶液とエタノール(99.9%)の3:1(v / v)溶液に犠牲層を250 mA / cm²の定電流密度で30秒間エッチングします。次に、得られたPSi膜の表面をエタノールで3回すすぎ、窒素流下で乾燥させます。
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6. ッチングしたばかりの多孔質層を水酸化ナトリウム(NaOH)水溶液(0.1 M)に2分間溶解します。次に、エタノールで3回すすぎ、窒素流で乾燥させます。
7. サンプルをHF(48%)、ddH₂O、およびエタノール(99.9%)(1:1:3 v / v)の溶液に2分間浸漬します。次に、エタノールで3回すすぎ、窒素流で乾燥させます。
8. SiサンプルをHF水溶液とエタノール(99.9%)の3:1(v / v)溶液中で250 mA / cm²の定電流密度で20秒間電気化学的にエッチングします。次に、得られたPSi膜の表面をエタノールで3回すすぎ、窒素流下で乾燥させます。
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9. ッチングしたばかりのPSiサンプルを管状炉で800°Cの管状炉で周囲空気中(加熱速度:25°C/分、自然冷却)で1時間熱酸化し、多孔質_SiO2(_{PSiO 2})足場を形成します。
10. PSiO₂サンプルを正の厚いフォトレジストで4,000 rpmで1分間スピンコートし、コーティングされたサンプルを90°Cで2分間焼成します(加熱速度:5°C/分、自然冷却)。
11. PSiO₂サンプルをダイシングソーを使用して8mm×8mmサンプルにダイスします。
12. フォトレジストを除去するには、さいの目に切ったサンプルをアセトンに3時間浸します。次に、エタノールで完全にすすぎ、窒素流下で乾燥させます。

2. PSiO₂に神経成長因子(NGF)をロードするNGF

1. ローディング溶液を調製するには、20 μgのマウスβ-NGFを0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)とddH₂Oの1:1(v / v)溶液400 μLに溶解します。
2. PSiO₂サンプルの上に52 μLのローディング溶液を加え、キャップをかぶったディッシュ内で室温(RT)で2時間インキュベートします。
   注:インキュベーション中に溶液が乾燥するのを防ぐために、ディッシュ内の湿度を高く保ちます。
3. PSiO₂担体内のNGF含有量を定量するために、サンプルの上に溶液を収集します。
   注:PSiO₂へのNGFローディングは、意図された使用の直前に実行する必要があります;タンパク質の乾燥と変性のリスクがあるため、ここでプロトコルを一時停止することはできません。

3. NGF負荷PSiO₂キャリア

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1. ット褐色細胞腫(PC12)細胞培養
   1. 10%ウマ血清(HS)、5%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および0.2%アムホテリシンをローゼルパーク医学研究所(RPMI)培地に添加して、塩基性増殖培地を調製します。
   2. 1%HS、1%L-グルタミン、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および0.2%アムホテリシンをRPMI培地に添加して、分化培地を調製します。
   3. 細胞懸濁液(10⁶細胞)を10 mLの塩基性増殖培地を入れた75 cm²培養フラスコで8日間増殖させます。2日ごとに、10 mLの塩基性増殖培地をフラスコに加えます。
   4. 分化したPC12細胞培養を生成するには、細胞懸濁液を遠心分離管に移します。細胞を200 x gで8分間遠心分離し、室温で上清を廃棄します。
   5. 細胞を5 mLの新鮮な塩基性増殖培地に懸濁し、細胞を200 x g で5分間再遠心分離し、RTします。上清を廃棄し、細胞ペレットを3 mLの塩基性増殖培地に再懸濁します。
   6. 細胞クラスターを分離するには、23 Gシリンジを使用して細胞を10回吸引します。
   7. 血球計算器セルカウンターを使用して細胞をカウントし、分化培地の存在下でコラーゲンI型コーティングプレートに10⁴細胞/ cm²作業領域を播種します。
   8. 24時間後、プレートごとに新鮮なマウスβ-NGF(50 ng / mL)またはNGFを充填したPSiO₂担体を加えます。
      >注:より高いNGF濃度(>50 ng / mL)は、指定された濃度と正確な効果を持っています。
   9. 分化培地を2日ごとに更新します。
   10. 細胞生存率を評価するには、代表的な時点で生存率指示薬溶液(レサズリンベース)を10%(v / v)添加し、37°Cで5時間インキュベートします。分光光度計を使用して490 nmでの吸光度を測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
セトン	ガドット	830101375
アムホテリシン	バイオロジカルインダストリーズ	03-028-1B
性HF(48%)	Merck	101513
AZ4533フォトレジスト	メタルケム株式会社	AZ4533
BSA フラクション v	MP バイオメディカル	216006950
BSA 溶液 (10%)	バイオロジカル インダストリー	03-010-1B
コラーゲン タイプ l	コーニング社	354236
コラゲナーゼ	Enco	LS004176
コラーゲンコーティングされたプラスチック カバーガラス	NUNC Thermanox	1059846
D-(+)-グルコース	シグマ アルドリッチ ケミカル	G8170
ディスパーゼ II	シグマ アルドリッチ ケミカルズ	4942078001
エタノール アソリュート (99.9%)	メルク	818760
FBS	Biological Industries	04-121-1A
グアニジン-HCl	シグマ-アルドリッチ ケミカルズ	G7294
ハムの F-12 栄養混合物	Thermo Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1M)	Thermo Scientific	15630-056
HS	Biological Industries	04-124-1A
L-15 medium	Sigma-Aldrich Chemicals	L5520
Laminin	Thermo Scientific	23017015
L-グルタミン	Biological Industries	03-020-1A
マウス β-NGF	Peprotech	450-34-20
ノーマルロバ血清 (NDS)	Sigma-Aldrich Chemicals	G9023
パパイン	Sigma-Aldrich Chemicals	p-4762
PBS (pH 7.4)			10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl、および 2.7 mM KCl を二重蒸留水 (ddH₂O、18 MΩ・cm) に溶解して調製します。
PBS X10	Biological Industries	02-020-1A
PC12 細胞株	ATCC	CRL-1721
ペニシリン-ストレプトマイシン	Biological Industries	03-032-1B
Poly-L-リジン	Sigma-Aldrich Chemicals	P4832
PrestoBlue 試薬	Thermo Scientific	A13261
RPMI媒体	バイオロジカルインダストリー	01-100-1A
Siウェーハ	シルトロニクス株式会社		高 B ドープ、p タイプ、0.00095 Ω-cm 抵抗率、<100> 配向ア
ジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich Chemicals	S2002
水酸化ナトリウム (NaOH)	Sigma-Aldrich Chemicals	S8045
タンニン酸	Sigma-Aldrich Chemicals	403040
Triton X-100	Chem-Impex International Inc.	1279

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